CD200基因转染的人胎盘间充质干细胞对异基因小鼠皮肤移植免疫排斥调节作用的研究

摘要

目的：研究CD200基因转染的人胎盘间充质干细胞(HPMSCs)对异基因小鼠皮肤移植免疫排斥调节的作用,为进一步阐明CD200基因的免疫调节机制提供新线索。为了在动物模型中进行这一研究,在本课题中我们将用表达小鼠CD200基因的人胎盘间充质干细胞代替人CD200阳性间充质干细胞亚群,并将研究结果作为后续的直接用人CD200阳性人胎盘间充质干细胞亚群作人体条件的研究提供依据。
　　方法：构建表达小鼠CD200基因的重组腺病毒载体,并用此载体转染人胎盘间充质干细胞,建立表达小鼠CD200基因的人胎盘间充质干细胞。待表达小鼠CD200基因的胎盘间充质干细胞长至60~70％密度的时候,用Triple消化成单细胞悬液。选择40只C57BL/6小鼠作为受体,以Vr:CD1(ICR)乳鼠皮肤作为供体,建立小鼠异基因皮肤移植排斥模型。C57BL/6小鼠随机分为4组:①A组(空白对照组1):C57BL/6小鼠自体皮肤移植;②B组(对照组2):同种异基因移植+PBS尾静脉注射;③C组(对照组3):同种异基因移植+HPMSCs尾静脉注射;④D组(实验组):同种异基因移植+表达小鼠CD200的HPMSCs尾静脉注射。检测项目包括:移植皮片存活时间,HE染色观察移植皮片病理改变,术后7d受体小鼠血液白细胞数量,腹腔液巨噬细胞活化率,ELISA、RT-PCR方法检测受体小鼠血液、脾脏中IL-4、IL-17及IFN-γ表达量的变化。
　　结果：(1)经PCR、酶切、测序及GFP表达证实携带CD200基因的重组腺病毒载体rAd-4-mCD200构建成功。(2)GFP、Real-TimePCR检测rAd-4-mCD200转染的人胎盘间充质干细胞可以成功表达mCD200基因。(3)皮肤移植术后7d,移植皮片存活情况观察C组较B组移植皮片存活时间延长(p<0.001);D组较B组和C组移植皮片存活时间延长(p<0.001,p<0.001)。HE染色结果显示,D组较B组小鼠皮肤炎细胞浸润明显减少。移植后7d受体小鼠血液中白细胞计数D组较A组和B组白细胞数量明显减少(p<0.05,p<0.05)。C组和D活化型巨噬细胞的数量明显多于A组和B组(p<0.05,p<0.05,p<0.05,p<0.05)。ELISA检测结果表明:C组和D组较A组IL-4含量明显减少(p<0.05,p<0.05);C组和B组比较,IL-17和IFN-γ含量明显降低(p<0.01,p<0.01);D组较B组,IL-17和IFN-γ含量明显降低(p<0.001,p<0.001);D组和A组比较,IL-17含量明显降低(p<0.01)。RT-PCR测定结果表明,C组IL-4、IL-17和IFN-γ的分泌量明显低于B组(p<0.05,p<0.01,p<0.01);D组较B组,IL-4、IL-17和IFN-γ的分泌量明显降低(p<0.01,p<0.01,p<0.01);C组和D组的IFN-γ的分泌量也明显低于A组(p<0.01,p<0.05)。
　　结论：成功制备表达小鼠CD200基因的重组腺病毒rAd-4-mCD200。此病毒能在人胎盘间充质干细胞中高效的表达。异基因小鼠皮肤移植后尾静脉输注HPMSCs和表达CD200基因的HPMSCs,均可以保护异体移植皮片。但表达CD200基因的HPMSCs较HPMSCs,移植皮片存活时间延长,说明CD200在其中发挥了免疫抑制作用。HPMSCs及表达CD200基因的HPMSCs可抑制免疫排斥反应,其机制可能与T细胞分泌的IL-4、IL-17及IFN-γ等相关细胞因子有关。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

前言

第一部分 小鼠CD200基因重组腺病毒载体构建

材料与方法

1.实验材料

2．实验方法

实验结果

1. pYr-ads-4-mCD200腺病毒穿梭载体鉴定

2. 重组腺病毒载体 pAd-4-mCD200 的酶切鉴定

3. 重组腺病毒 rAd-4-mCD200 的 PCR鉴定

4.重组腺病毒的致病变效应

第二部分 构建表达小鼠CD200基因的人胎盘间充质干细胞

材料与方法

1. 实验材料

2．实验方法

结果

3.1 HPMSCs生物学特征

3.2 HPMSCs生长曲线

3.3 mCD200重组腺病毒载体转染人胎盘间充质干细胞

3.4 real-time PCR检测mCD200基因表达

第三部分 异基因小鼠皮肤移植

材料与方法

1.实验材料

2.实验方法

3.0 ELISA检测受体小鼠血液中IL-4、IL-17及IFN-γ的表达

实验结果

1. 术后小鼠生理情况及移植皮片存活情况观察

2. 移植皮片病理切片HE染色

3. 移植后7d受体小鼠血液白细胞计数

4. 移植后7d受体小鼠腹腔液巨噬细胞活化率

5．移植后受体血液中细胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的检测

6. 脾脏中细胞因子IL-4、IL-17、IFN-γ的检测

讨论

结论

参考文献

附录

综述

致谢

四、攻读学位期间发表的学术论文

五、个人简历