小鼠肝脏特异性基因转染方法、转基因人源化小鼠模型及其构建方法

摘要

本发明公开了一种以慢病毒基因转染法和静脉高压注射转染法为基础的小鼠肝脏特异性基因转染方法。该方法将慢病毒基因转染法和静脉高压注射转染法巧妙地结合在一起，通过该方法可以使外源基因特异性地在小鼠肝脏中表达，且对肝脏的损伤可在短时间内恢复。通过本转染方法可在小鼠肝脏内表达外源基因，该技术可以用于转基因人源化小鼠模型的建立。用本发明的方法可以作为建立疾病动物模型的一种手段。

说明书

技术领域

本发明属于生物学领域，涉及小鼠肝脏特异性基因转染方法以及转基因人源化 小鼠模型的构建方法，包括肝脏高效表达调控元件调控的肝脏特异性重组慢病毒载 体构建，肝脏高效表达调控元件调控的重组慢病毒制备，通过水动力基因转染技术 建立的持续表达HCV入侵分子hCD81和hOCLN并可被HCV自然感染的转基因人源化 小鼠模型的建立。本发明涉及该模型在未来的抗HCV药物筛选和疫苗评价中的医学 应用。

背景技术

慢病毒基因转染法是以慢病毒作为载体的基因转染方法。该技术作为一种常规 的基因转染方法，可以将外源基因递送到分裂期细胞或者不处于分裂期的细胞，通 常被用于基因治疗或转基因动物模型的建立。慢病毒载体系统是在人类免疫缺陷病 毒(human immunodeficiency virus，HIV)基因组的基础上改造而成。该载体系 统由包装质粒、包膜质粒和表达质粒构成，其中表达质粒是慢病毒载体的核心质粒。 慢病毒载体系统相对于腺病毒载体或重组逆转录病毒载体具有不可比拟的优势，可 稳定整合于靶细胞基因组，实现基因的持续稳定表达。然而，该技术由于诱导宿主 天然免疫反应导致慢病毒的清除，从而造成转染失败。

水动力基因转移技术是一种简便、高效的体内基因转染方法，近年来已有成熟 发展。它是在高压下经小鼠尾静脉快速注射含目的基因重组质粒的生理盐水，从而 在小鼠体内(主要在小鼠肝脏)实现目的基因的高效表达，常用于动物实验和实验 动物的造模。然而，这种经典的小鼠活体动物转染技术也存在许多局限性，例如转 入的目的基因重组质粒在小鼠体内存留时间短，不能整合到宿主染色体内，从而无 法实现基因的持续表达。然而，该技术由于转染时间短，不易诱导宿主免疫反应。

发明内容

针对现有的转基因人源化小鼠模型构建方法(慢病毒基因转染法和水动力基因 转移技术)中转染失败和表达时间短等问题，本发明的目的联合慢病毒基因转染法 和水动力基因转移技术，提供一种在肝脏中特异、持续表达外源基因的转基因人源 化小鼠模型构建方法。

本发明所提供的基因转染方法，是将大于10⁵IFU携带有目的基因的重组慢病 毒溶解于相当于小鼠体重8％-12％的生理盐水中，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉 中，24小时后目的基因在小鼠肝脏中获得表达。

在上述基因转染方法中，所述携带有目的基因的重组慢病毒的注射量优选为 10⁶IFU，所述生理盐水的注射量优选为小鼠体重的10％，所述注射速度优选为3秒， 所述目的基因的表达时间优选为24小时以上。

在上述基因转染方法中，所述目的基因可以根据需要构建的小鼠模型进行选择, 外源基因既可以是表达指示作用的报告基因,如萤火虫荧光素酶基因,还可以是介 导外源病原体进入肝细胞的分子编码基因,如介导HCV进入肝细胞的hCD81和hOCLN cDNA。

在上述基因转染方法中，用于构建携带有目的基因重组慢病毒质粒的出发质粒 可为任何一种表达外源基因的慢病毒表达质粒，如以pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro为出 发质粒构建的携带Fluc基因的重组表达质粒为pCDH-EF1-Fluc。

所述的小鼠模型可根据需要构建的小鼠模型进行选择，如成年鼠、新生鼠或乳 鼠，优选6-8周龄的成年鼠。

本发明还提供了一种转基因小鼠模型构建方法，包括以下步骤：

1)携带目的基因的重组慢病毒载体构建；

2)重组慢病毒制备；

3)将携带有目的基因的重组慢病毒溶解于相当小鼠体重8％-12％的生理盐水 中，以小于5秒的速度注于小鼠尾静脉中，24小时后目的基因在小鼠肝脏 中获得表达，得到转基因小鼠模型。

其中目的基因、出发质粒、小鼠类型均参考上述基因转染方法的内容。

在肝脏特异性转基因小鼠模型构建中，所述目的基因为编码介导HCV感染肝脏 的基因，具体可为肝脏特异性增强子和启动子调控的hCD81和hOCLN cDNA。

具体肝脏特异性转基因人源化小鼠模型的构建，包含以下步骤：

(1)以pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro为出发载体构建嵌合肝脏特异性增强子和启动 子序列调控的慢病毒表达载体，命名为pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro；

(2)将hCD81和hOCLN cDNA插入pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro中，分别构 建重组慢病毒表达质粒命名为pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-OCLN；

(3)将质粒pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN分别转入包装 细胞得到慢病毒；

(4)将hCD81和hOCLN基因的慢病毒各10⁵IFU，溶解于生理盐水中，通过尾 静脉将两种混合病毒注入小鼠体内，之后正常喂养，转染24h后得到肝脏中特异性 表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠模型。

在肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN的转基因小鼠模型也属于本发明。

所述转基因小鼠模在疫苗评价或抗HCV药物筛选中的应用也属于本发明。

基于上述提供的基因转染方法、转基因小鼠模型构建方法、小鼠人源化肝脏特 异性基因转染方法，本发明联合了慢病毒基因转染技术和水动力基因转移技术，将 慢病毒基因整合特性和水动力的肝脏特异转染特性巧妙地结合在一起，通过该方法 可以使外源性基因特异性地在小鼠肝脏中表达，且验证对肝脏组织所造成的损伤可 在4天左右恢复。该方法可实现包含人源基因的重组慢病毒质粒在小鼠肝脏内表达 目的蛋白。该技术可用于HCV感染小鼠模型的建立和HCV疫苗评价和抗HCV药物筛 选，例如，通过转染介导HCV入侵靶细胞的分子hCD81和hOCLN cDNA到6～8周的 Balb-C小鼠，可以建立持续表达HCV入侵分子的转基因人源化小鼠模型。用本发明 的方法可以评价转基因人源化小鼠模型的肝脏对嗜肝性病原体的易感性改变，也是 建立疾病动物模型的一种手段，应用前景广泛。

下面结合具体实施对本发明做进一步详细说明。

附图说明

图1为重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-Luc构建示意图

图2A和图2B为活体荧光成像结果显示慢病毒水动力法转染重组慢病毒pCDH- AlbEhAATP-Luc后不同时间点小鼠肝脏中萤火虫荧光素酶的表达情况

图3A和图3B为慢病毒水动力法转染重组慢病毒pCDH-AlbEhAATP-Luc后不同 时间点小鼠肝功能转氨酶ALT和AST的检测结果

图4为重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81构建示意图

图5为重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-hOCLN构建示意图

图6显示实时定量RT-PCR法检测转基因人源化小鼠模型肝脏中hCD81和hOCLN mRNA的转录

图7显示免疫组化法检测转基因人源化小鼠模型肝脏中hCD81(A)和hOCLN(B) 分子的表达

图8显示实时定量RT-PCR法检测HCV阳性血清感染小鼠的肝脏中病毒核酸含 量

图9显示实时定量RT-PCR法检测HCVcc感染小鼠的肝脏中病毒核酸含量

具体实施方式

针对现有的转基因人源化小鼠模型构建(慢病毒基因转染法和水动力基因转移 技术)分别存在转染失败和表达时间短的问题，本发明联合慢病毒基因转染法和水 动力基因转移技术，提供一种在肝脏中特异、持续表达外源基因的转基因人源化小 鼠模型构建方法。实施例基于前述技术方案，是对技术方案的详细说明，不应理解 为对其的限制。实施例中使用了具体的目的基因、出发载体及各种实验材料以达到 具体公开的目的，与其类似功能的材料可以做等同替换，也属于本发明公开内容。

下述实施例中所用方法如无特殊说明均未常规方法。实施例中PCR法扩增目 的基因所需引物见表1，RT-PCR法测定转基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN 表达所需引物见表2。

表1:PCR法扩增目的基因所需引物

表2:RT-PCR法测定转基因人源化小鼠模型中CD81和OCLN表达所需引物

实施例1、慢病毒水动力基因转染方法的建立

该实施例以具有表达指示作用的报告基因萤火虫荧光素酶基因作为外源基因 的代表，说明慢病毒水动力基因转染方法的成功建立。

一、重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-Luc的构建

重组慢病毒表达载体pCDH-AlbEhAATP-Luc是将AlbEhAATP-Luc序列(序列表 中序列1)插入慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(购自SBI公司)的SpeI和NotI 位点间得到的载体。

具体制备如下：

以慢病毒质粒pGL3(Promega公司)为模板，加入扩增目的基因的引物(见表 1)，PCR方法扩增萤火虫荧光素酶(Luc)基因，经XbaI和Not I双酶切后插入 慢病毒骨架载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro的酶切位点之间，构建为重组慢病毒表达 载体，命名为pCDH-AlbEhAATP-Luc(见图1)。

二、重组慢病毒的包装和浓缩

将质粒pCDH-AlbEhAATP-Luc利用脂质体介导的方法转入包装细胞293FT，进 行慢病毒的包装。收集转染3天的细胞培养上清，33500rpm，4℃，离心2h超速 离心，得到浓缩的重组慢病毒。

三、慢病毒水动力基因转染方法的建立

将步骤二中浓缩的重组慢病毒，选择6～8周的雄性Balb-C小鼠5只(购自军 事医学科学院实验动物中心)，将10⁵IFU的病毒溶解于小鼠体重10％的生理盐水 中，以4秒的速度注入小鼠尾静脉中，分别在转染后的3天，7天，15天和30天， 按照150mg/Kg的用量小鼠腹腔注射Fluc的作用底物D-Luciferin(购自Promega 公司)，5min后麻醉小鼠，置于IVIS活体荧光成像仪进行监测。通过活体成像技 术可以观测到小鼠腹部肝脏位置有强烈的信号，结果如图2A所示，萤火虫荧光素 酶表达量见图2B。在转染后的第2天和第4天分别对小鼠进行尾静脉取血，进行转 氨酶ALT和AST的测定，结果如图3A和图3B所示，表明在转染后的第四天小鼠肝 功恢复到正常水平。

如前所述，本实施例慢病毒水动力基因转染，是将大于10⁵IFU的重组慢病毒 溶解于相当于小鼠体重8-10％的生理盐水中，以小于5秒的速度注射于小鼠尾静脉 中，3天后即能检测到目的基因在小鼠肝脏处获得了表达。

实施例2、慢病毒水动力基因转染方法构建hCD81和hOCLN的转基因人源化小 鼠模型

将实施例1建立的转基因方法实际应用到生物医学相关实践当中，本实施例通 过该方法构建HCV感染的动物模型。

一、重组慢病毒载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN的构建

重组慢病毒表达载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN为分别 将AlbEhAATP-hCD81(序列表中序列2)和AlbEhAATP-hOCLN(序列表中序列3)插 入慢病毒载体pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(购自SBI公司)的SpeI和NotI位点间得 到的载体。

具体制备如下：

分别以小鼠肝癌细胞Hepa1-6(吕丽萍,贾帅争,王海平,詹林盛,王全立.人LDLR 基因的克隆及在Hepal-6细胞中的表达.军事医学科学院院刊,2004；28:212-214) 和人肝癌细胞(Huh7.5.1)的DNA为模板，设计扩增目的基因的引物(表1)，使 用PCR方法扩增小鼠肝脏特异性白蛋白增强子序列(AlbE)和人肝脏特异性α-抗 胰蛋白启动子序列(AATP)，平端连接后构建为嵌合肝脏特异性增强子序列和启动 子序列(In Vitro and in Vivo Comparative Study of Chimeric Liver-Specific  Promoters)，经SpeI和XbaI双酶切后插入处理好的慢病毒骨架载体 pCDH-EF1-MCS-T2A-Puro(购自SBI公司)的酶切位点之间，构建为嵌合肝脏特异 性增强子和启动子序列调控的慢病毒表达载体，命名为 pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro。

设计扩增目的基因的引物(表1)，利用TRIzol(Promega)从QSG 7701细 胞(肝内皮细胞系，吕丽萍等，Hepatocytes transduced with human TERT gene  acquire a prolonged lifespan in culture and retain permissiveness to  hepatitis B virus.Acta virologica,2013；57:305-311)进行总RNA的提取， 以提取的RNA为模板，Oligod(T)₁₅为引物，进行反转录PCR，以合成的cDNA为模 板，分别加入扩增目的基因(hCD81或hOCLN)的特异性引物进行PCR扩增。扩增 hCD81的反应程序为94℃2min预变性后，94℃30sec,58℃30sec,72℃30 sec,35个循环后，72℃7min。扩增hOCLN的反应程序为94℃2min预变性后，94 ℃30sec,58℃30sec,72℃1.5min,35个循环后，72℃7min。1％琼脂糖凝胶 电泳后回收目的片断，与T-Vector的连接后转化，挑取阳性克隆进行序列测定。 测定结果显示扩增的序列正确。挑取测序正确的克隆进行摇菌扩增，提取质粒，利 用限制性内切酶XbaI和NotI将目的片断切下，插入pCDH-AlbEhAATP-MCS-T2A-Puro 中，分别构建了重组慢病毒表达载体pCDH-AlbEhAATP-hCD81(图4)和 pCDH-AlbEhAATP-hOCLN(图5)。

二、重组慢病毒的包装和浓缩

将质粒pCDH-AlbEhAATP-hCD81和pCDH-AlbEhAATP-hOCLN利用脂质体介导的方 法分别转入包装细胞293FT，进行慢病毒的包装。收集转染3天的细胞培养上清， 33500rpm，4℃，离心2h超速离心，得到浓缩的慢病毒。

三、慢病毒水动力基因转染方法建立肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的 转基因人源化小鼠模型

收集并浓缩带有hCD81和hOCLN基因的慢病毒各10⁵IFU，溶解于相当于BALB/c 小鼠(6～8周，购自军事医学科学院实验动物中心)体重10％的生理盐水中，以4 秒的速度通过尾静脉将两种混合病毒注入小鼠体内，之后正常喂养，24小时后目的 基因在小鼠肝脏中获得表达，即能得到肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转 基因人源化小鼠模型，该模型可持续到转染后的第14天仍保持稳定。

通过以下实验确证肝脏中特异性表达hCD81和hOCLN分子的转基因人源化小鼠 模型的构建成功：

(1)转染14天后，将小鼠脱臼处死，取肝脏后加入液氮用组织碾磨器碾碎， 利用TRIzol法提取总RNA，实时定量RT-PCR法检测hCD81和hOCLN mRNA的转录， 各反应成分的加量为2×SYBR Premix Ex Taq 10μl(大连TaKaRa公司)，上下游引 物(表2)0.5μl(内对照基因GAPDH)，cDNA模板1ul，ddH₂O₂8ul，反应参数 为：98℃预变性2min,95℃变性5sec，56℃退火20sec，72℃延伸15sec，40 个循环后进行熔链曲线分析，95℃15sec，将实时定量PCR产物从60℃缓慢而均 匀地升温至95℃，升温时间为10min，定时读取荧光值，由实时荧光定量PCR仪 自动计算出各基因的表达水平并绘制出熔链曲线。定量RT-PCR结果如图6。

(2)免疫组化法检测hCD81和hOCLN在小鼠肝脏中的表达。

转染14天后，将小鼠脱臼处死，取出肝脏，固定24h以上。将固定后的组织 精细取材后，于4℃下脱水、透明，52℃低熔点石蜡浸蜡包埋制成蜡块。切片机对 蜡块进行连续切片，厚度为4μm，贴于载玻片上，56℃烘箱内烤干备用。免疫组化 法采用SP法：制片后常规二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，柠檬酸钠缓冲液进行微波 抗原修复，PBS洗片3次，每次5min,放入湿盒中。0.3％H₂O₂孵育，室温10min。PBS 洗片3次，每次5min。正常血清(1：10)孵育，室温20min。除去多余血清滴加 鼠抗人CD81抗体(1：200)一抗(购自Santa Cruz公司)100μl于切片上，4℃， 12-16h。PBS洗3次，每次5min。滴加HRP标记的山羊抗小鼠IgG(购自北京中杉 金桥公司)100μl于切片上，室温30min。PBS洗3次，每次5min。DAB显色10min (购自北京中杉金桥公司)。充分水洗，苏木精复染、脱水、透明、封片、镜检及 显微镜摄影记录结果。hOCLN的检测步骤同上，兔抗人OCLN一抗(购自Invitrogen) 的孵育浓度为1：200。检测结果如图7，其中A幅箭头指示hCD81阳性的小鼠肝细 胞(彩图中棕色着色部分)，B幅箭头指示hOCLN阳性的小鼠肝细胞(彩图中棕色 着色部分)。

实施例3、HCV感染的小鼠模型的建立及检测

一、HCV 1b株感染的小鼠模型的建立及检测

将实施例2建立的转基因人源化小鼠模型感染HCV 1b型血清，具体步骤为： 实验组和对照组各取5只BALB/c小鼠,实验组(transgenic mouse)和对照组 (control)每只小鼠经尾静脉注射约3×10⁶IU/mL的HCV阳性血清。在感染后的3、 7和14天肝组织取材，提取总RNA，实时定量RT-PCR法检测小鼠肝脏中HCV RNA， 具体实验方法参照上海科华的HCV实时定量试剂盒使用说明进行。检测结果如图8， 显示实验组和对照组中在接种HCV阳性血清后(inoculum)，在小鼠体内均检测到 HCV RNA，但实验组要高于对照组，但3天后，实验组HCV RNA有下降但维持低水 平复制，对照组则下降到检测水平以下。

二、HCV 2a株感染的小鼠模型的建立及检测

将实施例2建立的转基因人源化小鼠模型感染HCV 2a病毒液，具体步骤为： 实验组(transgenic mouse)和对照组(control)各取5只BALB/c小鼠,实验组和 对照组每只小鼠经尾静脉注射约2.5×10⁸IU/mL的HCV 2a病毒液。在感染后的3、 7和14天肝组织取材，提取总RNA，实时定量RT-PCR法检测小鼠肝脏中HCV RNA， 具体实验方法参照上海科华的HCV实时定量实际盒使用说明进行。检测结果如图9， 显示实验组和对照组中在接种HCVcc后(inoculum)，在小鼠体内均检测到HCV RNA， 但实验组要高于对照组，但3天后，实验组HCV RNA有下降但维持低水平复制，对 照组则下降到检测水平以下。