小鼠卵母细胞染色质凝集的调控及咖啡因在山羊体细胞克隆中的应用

摘要

生发泡期卵母细胞染色质的一个共同特点是：随卵泡生长，弥散在整个细胞核区域中的染色质逐渐发生凝集，依物种不同，或在核仁周围凝集成环或形成其它凝集结构。先前有关卵母细胞染色质的研究主要集中在不同构型与减数分裂及发育能力的关系方面，对参与染色质凝集的分子及信号通路还知之不多。最近的研究表明后成性修饰，包括DNA甲基化及组蛋白修饰在调控染色质结构及基因表达过程中发挥了重要作用。本文以小鼠卵母细胞为实验模型，利用免疫荧光技术及相关特异性抑制剂，系统研究了DNA甲基化、组蛋白磷酸化和乙酰化在卵母细胞GV期染色质及MII期染色体凝集过程中的作用。结果发现：
　　 1、MPF及MAPK抑制剂处理后，卵母细胞GV期染色质凝集正常发生，表明MPF与MAPK均不参与染色质凝集
　　 2、卵母细胞GV期染色质与MII期染色体凝集均伴随DNA甲基化水平升高，但甲基化特异性抑制剂5-aza-cytidine处理后，染色质与染色体凝集仍然发生，表明DNA甲基化不是卵母细胞染色质及染色体凝集所必需
　　 3、卵母细胞GV期染色质与MII期染色体凝集均伴随组蛋白磷酸化水平升高，但磷酸化特异性抑制剂ZM447439处理后，染色质与染色体凝集仍然发生，表明组蛋白磷酸化不是卵母细胞染色质及染色体凝集所必需
　　 4、卵母细胞GV期染色质凝集伴随着组蛋白乙酰化水平升高，但HDACs抑制剂TSA处理后，GV染色质不再继续凝集但乙酰化水平仍然升高，表明HDACs参与GV期染色质凝集，但并非通过组蛋白乙酰化/去乙酰化途径
　　 5、卵母细胞MII期染色体凝集伴随组蛋白去乙酰化，TSA处理后，组蛋白保持乙酰化状态，但染色体凝集正常发生，表明组蛋白去乙酰化不是染色体凝集所必需
　　 6、GV期及MII期卵母细胞中，HATs/HDACs保持动态平衡，协同调节组蛋白的乙酰化/去乙酰化状态
　　 受核胞质制备是核移植过程中的重要环节，作为受核胞质的卵母细胞必须除去自身遗传物质，此过程通常称之为去核。去核不完全往往会使克隆胚染色体出现多倍性或非整倍性现象，直接导致克隆胚胎发育失败。化学辅助去核是指利用药物处理卵母细胞使之形成含核物质的突起，再通过显微操作去除突起而去核。这种去核方式因其操作简便、对卵母细胞发育能力损伤较小而得到广泛应用。目前所用化学辅助去核药物一般为微管抑制剂，通过破坏纺锤体形成进而扰乱染色体分离，从而实现辅助去核。咖啡因和MG132通常用于升高MPF活性，尚未见将这两种药物应用于卵母细胞辅助去核的报道。本文首先研究了成熟培养液中添加半胱胺和胱氨酸对山羊卵母细胞孤雌胚胎及核移植胚胎发育的促进作用，然后利用此优化的成熟培养系统，首次将咖啡因和MG132这两种非微管抑制剂应用于山羊卵母细胞的化学辅助去核，结果发现：
　　 1、成熟培养液中添加100μM半胱胺和200μM胱氨酸可促进山羊孤雌胚胎的体外发育
　　 2、成熟培养液中添加100μM半胱胺和200μM胱氨酸可促进山羊体细胞核移植胚胎的体外发育
　　 3、1mM的Caffeine和5μM的MG132处理30分钟可诱导80％山羊MII期卵母细胞产生胞质突起
　　 4、与Demecolcine相比，Caffeine和MG132处理后不破坏山羊MII期卵母细胞的纺锤体结构
　　 5、Caffeine和MG132处理诱导胞质突起后不损害山羊孤雌胚胎的体外发育能力
　　 6、与盲吸去核相比，Caffeine和MG132诱导突起后去核率较高，并能提高核移植胚胎的体外发育能力
　　 7、Caffeine处理诱导产生的胞质突起的持续时间长于MG132处理，与Demecolcine处理相当
　　 8、Caffeine辅助去核的体细胞核移植胚胎可发育到期

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一章 小鼠卵母细胞染色质凝集的调控

1、 前言

1.1 哺乳动物染色质构型的分类

1.2 卵母细胞发育过程中的染色质凝集

1.3 MPF及MAPK与染色质凝集

1.4 DNA甲基化与染色质凝集

1.5 组蛋白修饰与染色质凝集

1.6 实验目的

2 材料与方法

2.1 实验小鼠

2.2 卵母细胞的获取

2.3 卵母细胞培养及处理

2.4 免疫荧光检测

2.5 Western Blot

2.6 数据统计

3 结果

3.1 小鼠GV期卵母细胞染色质构型的划分

3.2 MPF及MAPK对GV期卵母细胞染色质凝集的影响

3.3 DNA甲基化与染色质凝集

3.4 组蛋白磷酸化与染色质凝集

3.5 组蛋白乙酰化与染色质凝集

3.6 HATs/HDACs在卵母细胞染色质及染色体凝集中的作用

4 讨论

4.1 MPF与MAPK与染色质凝集

4.2 DNA甲基化与染色质凝集

4.3 组蛋白磷酸化与染色质凝集

4.4 组蛋白乙酰化与染色质凝集

4.5 HATs/HDACs的平衡与卵母细胞染色质及染色体的乙酰化状态

5 结论

第二章 咖啡因在山羊体细胞克隆中的应用

1、 前言

1.1 盲吸去核法

1.2 荧光染色去核法

1.3 透明带穿刺去核法

1.4 末期去核法

1.5 蔗糖预处理去核法

1.6 偏振光显微镜去核法

1.7 半卵切割去核法

1.8 离心去核法

1.9 化学辅助去核法

1.10 实验目的

2 材料方法

2.1 卵母细胞的获取与成熟

2.2 显微操作针制备

2.3 盲吸去核

2.4 化学辅助去核

2.5 去核率检测

2.6 供核细胞处理

2.7 核移植及电融合

2.8 重构胚激活

2.9 重构胚培养

2.1 0 胚胎移植

2.11 受体羊妊娠诊断

2.12 数据分析

3 结果

3.1 成熟培养液中添加半胱胺和胱氨酸对山羊孤雌胚胎发育的作用

3.2 成熟培养液中添加半胱胺和胱氨酸对山羊SCNT胚胎发育的作用

3.3 不同浓度药物处理后山羊卵母细胞胞质突起形成情况

3.4 不同时间药物处理后山羊卵母细胞胞质突起形成情况

3.5 不同药物处理对微丝、微管及染色体的影响

3.6 不同药物处理诱导胞质突起后对卵母细胞孤雌发育的影响

3.7 不同药物处理诱导胞质突起后的去核率及其对SCNT胚胎发育的影响

3.8 药物撤掉后胞质突起在mD-PBS中的持续时间

3.9 不同辅助去核方案所获克隆胚的体内发育情况

4 讨论

4.1 成熟培养液中添加半胱胺和胱氨酸对卵母细胞发育能力的影响

4.2 Caffeine和MG1 32在化学辅助去核中的应用

5 结论

参考文献

致谢

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