猪肌内脂肪沉积相关基因的筛选鉴定及其特征分析

摘要

肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)是影响肉质的一个重要指标,其含量与肉的风味、嫩度等优良肉质性状呈正相关。由于IMF含量在活体和早期难以测定,常规育种较难进行。目前,人们从营养和遗传角度对猪IMF沉积进行了大量研究,但营养调控只能改善IMF的沉积,影响IMF沉积的主效基因又尚未确定。因此,为筛选影响猪IMF沉积的相关基因,以进一步揭示IMF沉积的分子机理,本研究以IMF含量丰富的莱芜猪和IMF贫乏的大白猪为研究材料,运用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术构建高、低IMF莱芜猪和莱芜猪与大白猪的正反抑制性消减杂交文库,筛查和鉴别差异表达基因,并对其中的部分基因进行real-time PCR验证;另外,在候选基因的研究上,对猪NDUFS4基因进行了克隆和表达分析。主要结果如下:
　　一、应用SSH技术构建了高IMF莱芜猪与低IMF莱芜猪正反消减杂交文库。正反向文库扩增后分别得到631和486个阳性克隆,PCR鉴定结果表明插入片段主要分布在0.1-1.0 kb之间。使用反Northen斑点杂交技术对以高IMF莱芜猪为Tester,低IMF莱芜猪为Driver的正向文库进行筛选,得到97个阳性差异克隆,进行测序、聚类拼接后得到35条单一ESTs序列。将这些序列在NCBI中进行BLAST比对分析,发现其中有17条ESTs与已知功能基因高度同源,3条ESTs在猪上有预测序列,15条ESTs序列与未知功能的cDNA片段高度同源。
　　二、应用SSH技术构建了莱芜猪与大白猪正反抑制性消减杂交文库。正反向文库扩增后分别得到1039和856个阳性克隆,PCR鉴定结果表明插入片段主要分布在0.1-2kb之间。使用反Northen斑点杂交技术对正反向文库进行筛选,以莱芜猪为Tester,大白猪为Driver的正向文库中获得154个阳性差异克隆,以大白猪为Tester,莱芜猪为Driver的反向文库中获得93个阳性克隆。进行测序、聚类拼接后,正向文库得到83条单一的ESTs序列,反向文库获得55条单一ESTs。在NCBI中进行BLAST比对分析后发现,正向文库中有33条ESTs与已知功能基因高度同源,15条ESTs在猪上有预测序列,25条ESTs序列与未知功能的cDNA片段高度同源,另有10条ESTs未找到明显的同源序列;反向文库中有21条ESTs与已知功能基因高度同源,8条ESTs在猪上有预测序列,18条ESTs序列与未知功能的cDNA片段高度同源,另有8条ESTs未找到明显的同源序列。
　　三、对与已知功能基因以及有预测序列的基因进行在线分类分析,发现这些基因参与了多种生物学过程;对其中的部分基因或ESTs进行了real-time PCR的验证,有13个基因或EST与文库筛选结果一致,其中上调基因11个,分别是:SERF2、ATP6、NDUFS4、SERPINF1、h142(EST)、ACSL1、ADFP、ACADM、HNRNPA2B1、PDK4、P311基因,下调基因2个,分别是:AMPD1和PGK1基因。
　　四、通过RT-PCR及RACE技术,我们得到了猪NDUFS4基因完整的cDNA序列。猪NDUFS4基因编码区核苷酸序列与人、小鼠、牛、大鼠的同源性分别为:92.99％、87.31％、93.56％、86.55％。猪NDUFS4基因氨基酸序列与牛的同源性最高为92.57％,与人、小鼠、大鼠的同源性分别为90.29％、88.57％、86.29％。对猪NDUFS4基因的在11种组织中的表达谱分析发现,该基因在检测组织中呈特异性表达,在背最长肌、脾脏、肾脏中高表达,肝脏、背膘、脑、脊髓中中度表达,心脏中低表达,肺、胃和大肠中几乎不表达。试验还对莱芜猪、大白猪背最长肌组织中NDUFS4基因 mRNA的表达情况进行了real-time PCR的分析,结果表明莱芜猪中NDUFS4基因的mRNA表达量显著高于大白猪。
　　综上所述,本研究对莱芜猪IMF沉积的机理进行了探讨,构建了高、低IMF莱芜猪和莱芜猪、大白猪抑制性消减杂交文库,经过筛选获得了一些在猪背最长肌中表达,并与IMF沉积有关的差异基因。另外首次克隆了猪NDUFS4基因并对其组织表达进行了分析,证明了NDUFS4基因分别在高、低IMF含量莱芜猪和莱芜猪、大白猪中的mRNA表达水平存在差异。所得研究结果为进一步揭示猪背最长肌中IMF沉积与遗传机理奠定了重要的分子基础。

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1 引言

1.1 猪肉IMF

1.2 差异表达基因的筛选方法

1.3 本研究的目的意义

2 材料与方法

2.1 试验材料

2.2 试验方法

2.3 统计分析

3 结果与分析

3.1 莱芜猪高、低IMF含量消减文库的构建

3.2 高、低IMF莱芜猪正向消减文库ESTs获得与分析

3.3 莱芜猪、大白猪消减文库的构建

3.4 莱芜猪、大白猪正反向消减文库ESTs获得与分析

3.5 猪NDUFS4基因的克隆表达及生物信息学分析

4 讨论

4.1 SSH分析

4.2 差异表达基因的验证与分析

4.3 NDUFS4与IMF沉积

5 结论

参考文献

致谢

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