葡萄酒酵母遗传操作构建高级醇低产菌株的研究

摘要

高级醇是葡萄酒酿造过程中酵母酒精发酵的主要次生代谢物，如果葡萄酒中高级醇含量过高，则会使消费者饮用后“上头”、头疼，给人以辛辣腐臭感、刺激性和不愉快的苦涩味，其不仅严重破坏了酒的口感和风味，而且降低了葡萄酒的营养价值和保健效果。目前该问题在新生葡萄酒和家庭自酿葡萄酒中尤为多见。因此寻找有效降低葡萄酒中高级醇含量的方法，对提高葡萄酒质量，促进葡萄酒产业的发展具有重要的现实意义。
　　 论文基于对葡萄酒酵母高级醇代谢机制的综合分析，筛选出了高级醇生成量较低的葡萄酒酵母菌种，然后利用酵母遗传操作方法（基因组重排和同源重组技术）对其高级醇代谢途径进行了调控，并探讨了发酵工艺条件（温度、pH值和二氧化硫添加量）对改造菌株高级醇生成的影响，主要获得了以下研究结果:
　　 1.本试验综合比较了葡萄酒酿造业常用的6株葡萄酒酵母(EC1118、RC212、CY3079、D254、QA23、DV10)的凝聚性、耐二氧化硫性能、高级醇产生量及香气感官特征，结果表明菌株EC1118发酵性能优良，具有较低的高级醇生成量。通过描述性感官评定，菌株EC1118所酿酒的果香、花香浓郁，刺激性较小。以此菌株作为本试验的出发菌株。
　　 2.采用EMS对二倍体酵母菌株EC1118进行诱变，获得了具有充分遗传多样性菌株群，并通过有性重组来实现基因组重排的方法，构建了具有低产高级醇特性的葡萄酒酵母菌株CP1118。测定结果表明，菌株CP1118总高级醇生成量为237.43mg/L，较菌株EC1118总高级醇生成量(276.39mg/L)降低了近14％，其中以正丙醇和异戊醇降低幅度最为明显，较EC1118分别降低了34％和7％。异丁醇降低幅度不大。正己醇和β-苯乙醇生成量略有升高，较EC1118分别增加了近5％和12％。
　　 3.试验进一步利用同源重组技术成功敲除了二倍体菌株CP1118酯酶分解酶基因IAH1，并获得了低产高级醇菌株QC1118。测定结果表明IAH1基因敲除菌株QC1118总高级醇生成量较出发菌株CP1118降低了近10％。其中异戊醇和β-苯乙醇降低幅度较大，分别降低了22％和23％。异丁醇和正己醇降低幅度较小，分别降低了近18％和5％。正丙醇生成量增加了近25％。菌株QC1118总高级醇生成量与原始菌株EC1118相比降低了近23％。菌株QC1118和CP1118感官品评试验表明，两株酵母在相同的感官特性上所表达的每种特性的强度不同。菌株QC1118发酵的酒样花香和果香比较明显，具有较低的刺激性，整体评价较高。
　　 4.试验从发酵工艺角度研究了温度、发酵醪pH值和葡萄破碎时二氧化硫添加量对酵母QC1118高级醇生成的影响。测定结果表明17℃发酵时酵母高级醇生成量最大，为377.30mg/L。26℃发酵条件下高级醇生成量最低，为159.32mg/L。在17℃～26℃发酵温区内酵母高级醇生成量随着发酵温度的升高而降低。发酵醪pH值对酵母高级醇生成影响不大，在pH值3.4时酵母高级醇生成量为269.19mg/L，其它pH值条件下酵母高级醇生成量均在244mg/L左右。二氧化硫添加量在30mg/L时高级醇生成量最大，为326.88mg/L。在110mg/L的二氧化硫添加量时酵母高级醇生成量最低，为264.91mg/L，较高的二氧化硫添加量有利于降低葡萄酒中高级醇含量。

目录

声明

论文说明

英文缩写符号及其中英文对照表

摘要

1 前言

1．1 葡萄酒中的高级醇

1．1．1 葡萄酒中高级醇形成机理

1．1．2 酵母高级醇相关基因的功能与调控研究

1．1．3 低产高级醇酿酒酵母菌株的选育研究

1．2 葡萄酒酵母遗传操作方法

1．2．1 随机诱变

1．2．2 进化工程

1．2．3 代谢工程

1．2．4 有性重组

1．2．5 基因组重排

1．3 本课题研究目的与意义

1．4 本课题研究内容

2 材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 菌种、质粒及引物

2．1．2 主要仪器

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要酶制剂

2．1．5 主要培养基

2．1．6 主要溶液

2．2 低产高级醇葡萄酒酵母的筛选

2．2．1 酵母凝聚性的测定

2．2．2 酵母二氧化硫耐受性分析

2．2．3 酵母高级醇生成能力比较分析

2．2．4 高级醇和酯类的测定(HS-SPME-GC-MS)

2．3 基因组重排构建低产高级醇葡萄酒酵母

2．3．1 酵母EMS诱变

2．3．2 突变文库的构建

2．3．3 酵母高效产孢法

2．3．4 孢子纯化方法

2．3．5 基因组有性重排

2．3．6 优势菌株的富集

2．3．7 突变菌株的分离

2．3．8 粗酶的制备

2．3．9 突变株酯酶分解酶活性的测定

2．3．10 突变株的遗传稳定性试验

2．4 基因敲除构建低产高级醇葡萄酒酵母

2．4．1 大肠杆菌感受态细胞的制备

2．4．2 质粒pUG6和pSH65的转化

2．4．3 碱裂解法制备pUG6和pSH65质粒DNA

2．4．4 IAH1基因敲除序列组件的构建

2．4．5 LiAc/SS载体DNA/PEG高效酵母转化法

2．4．6 kanMX标记基因的诱导切除

2．4．7 质粒pSH65的移除

2．4．8 菌落PCR验证酵母菌落

2．4．9 DNA琼脂糖凝胶电泳

2．4．10 重组菌的扩大培养与接种发酵试验

2．5 酿酒试验及主要分析方法

2．5．1 发酵工艺条件对酵母高级醇生成的影响研究

2．5．2 细胞生长状态的测定

2．5．3 葡萄酒基本理化指标的测定

2．6 统计分析方法

3 结果与分析

3．1 低产高级醇葡萄酒酵母的初步筛选

3．1．1 酵母凝聚性比较

3．1．2 酵母二氧化硫耐受性比较

3．1．3 不同菌株高级醇生成量比较

3．2 基因组重排构建低产高级醇葡萄酒酵母

3．2．1 最佳EMS诱变剂量

3．2．2 突变文库的构建

3．2．3 酵母EC1118的基因组重排

3．2．4 基因组重排后优势菌株的富集

3．2．5 富集后高级醇低产菌株的筛选

3．3 IAH1基因敲除的葡萄酒酵母菌株的构建

3．3．1 质粒pUG6的制备

3．3．2 嵌合引物的设计及IAH1基因敲除序列组件的构建

3．3．3 转化IAH1基因敲除序列组件及筛选转化子

3．3．4 质粒pSH65的制备

3．3．5 质粒pSH65的转化

3．3．6 kanMX标记基因的诱导切除

3．3．7 质粒pSH65的移除

3．3．8 IAH1基因敲除二倍体菌株的获得

3．3．9 IAH1基因敲除二倍体菌株的PCR验证

3．3．10 出发菌株与LAH1基因敲除菌株形态比较

3．3．11出发菌株与IAH1基因敲除菌株酿酒试验

3．4 发酵工艺条件对酵母高级醇生成的影响研究

3．4．1 温度对酵母高级醇生成量的影响

3．4．2 pH对酵母高级醇生成量的影响

3．4．3 二氧化硫添加量对酵母高级醇生成量的影响

4 讨论

4．1 高级醇与葡萄酒风昧

4．2 高级醇与葡萄酒“上头”

4．3 低高级醇葡萄酒酵母菌种选育方法的代谢基础

4．4 基因组重排构建高级醇低产葡萄酒酵母

4．5 基因敲除构建高级醇低产菌株

4．6 发酵工艺条件对酵母高级醇生成的影响

5 结论

论文的创新点与不足

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表论文情况