貂源H9亚型流感病毒的分离鉴定与血清学调查

摘要

流感病毒的宿主非常广泛其中高致病性禽流感病毒可跨越禽类感染其它哺乳动物的事件也不断有内部和公开报道，已报道的有猫、虎、狮、美洲豹、石貂、犬、雪貂等哺乳动物感染。目前，除我国外有多个国家和地区相继有水貂感染各种亚型流感病毒的情况的报道，例如H3N8、H5N1、H5N3、H7N3、H7N7、H8N4、H11N4等。随着我国水貂养殖业的不断发展，近几年出现临床特征主要为咳嗽、体温升高、呼吸困难、流鼻液的疑似流感病毒感染的症状。针对这一现象2013年3月本实验室对部分水貂的血清进行血清学检测，发现其血清中的流感病毒抗体水平较高，但是对该病毒的致病机制和传播机制尚不清楚。虽然而水貂感染流感病毒的研究和报道少之又少。
　　但是水貂到底能否感染流感病毒和能否在水貂中传播流感病毒，其主要感染的流感病毒亚型、流感病毒对水貂的致病性及其遗传演化分析、貂源流感病毒有哪些分子生物学特征等等目前都没有相关报道证实。针对这一现象本研究主要通过43份疑似病例利用鸡胚接种方法分离出2株新型貂源流感病毒并通过RT-PCR基因片段扩增试验方法确定为H9亚型流感病毒。并对山东地区的水貂进行随机抽样后与分离的新型貂源H9亚型AIV进行流行病学调查。主要研究内容如下:
　　1、本研究通过鸡胚接种方法进行病毒的分离，主要方法是从43份水貂肺组织疑似病料中通过研磨肺组织后取上清液接种于9-11日龄的SPF鸡胚培养3日后发现部分鸡胚有头部或全身出血现象，收取有血凝效价的尿囊液后于-20℃保存提纯后，结果获得2株流感病毒病毒，分别命名为A/mink/Shandong/F6/2013、A/mink/Shandong/F10/2013。
　　2、本研究通过RT-PCR方法对两株分离株的HA基因进行扩增，扩增产物经测序后进行Blast。结果表明这两株HA片段的基因序列所与甲型禽流感病毒H9亚型(A/chicken/Henan/HF/2012、A/chicken/Rizhao/853/2013)同源性最高，并具有一系列H9 AIV特征性遗传位点。
　　3、分离株HA基因片段的核酸序列分析结果所示经过HA基因片段核酸序列的分析发现这两株病毒的的HA基因序列相同，为同一病毒。基因序列分析表明A/mink/Shandong/F6/2013和A/mink/Shandong/F10/2013的HA基因片段与GenBank中收录的H9亚型AIV参考毒株的HA基因片段同源性在96.3％～97.9％之间。其中两株分离株的同源性为100％，与A/chicken/zhejiang/FSQ/2011和A/chicken/zhejiang/329/2011同源性最高为97.9％。
　　4、通过氨基酸序列分析结果表明分离株HA基因编码561个氨基酸，与A/ehicken/zhejiang/329/2011氨基酸序列同源性达到98.7％;蛋白裂解位点为PQ↓VPSRSSR，从分子水平推论，属于非高致病性毒株;分离株HA蛋白受体结合位点没有发生较大变异。
　　5、系统发生分析表明:新型貂源H9N2亚型流感病毒为禽流感病毒重组病毒，在经过了多年的进化发展之后部分基因发生了突变从而获得了可以感染水貂能力。分离株A/mink/Shandong/F6/2013和A/mink/Shandong/F10/2013系同一起源，分离株HA基因与A/chicken/Shanghai/20/2013和A/chicken/zhejiang/329/2011亲缘关系最近。
　　6、本研究通过血清学方法进行貂源禽流感病毒的流行病学调查，旨在确定水貂中是否存在感染新型貂源AIV的感染现象。本次研究中我们通过采集175份水貂血清对其进行新型貂源H9亚型AIV的血凝抑制实验检测，结果发现血清中发生血凝抑制反应有70份，占40％。初步说明山东地区部分水貂存在感染新型貂源H9亚型AIV现象。
　　本研究为流感病毒H9亚型在水貂种内的传播及流行提供科学数据和理论依据，对初步了解山东地区水貂养殖生产中对于流感病毒的感染类型和感染率提供具体地数据。从而在水貂的日常饲养管理中对于流感病毒的流行能够做好针对性的预防工作，如水貂源流感病毒疫苗的研究，水貂流感病毒快速诊断的研究，以及若在生产过程中出现流感病毒感染时进行有针对性的治疗将损失降到最低。本研究同时也具有重要的公共卫生学意义。同时也流感病毒的宿主特异性及流行性进行了有力的补充，为流感病毒的遗传演化提供理论数据和基础。为下一步貂源流感病毒的分子生物学研究做好铺垫。本研究也是国内首次对貂源流感病毒进行流行病学调查和分离鉴定。