貂源H9N2亚型流感病毒的分离鉴定和血清学调查及其传播特性研究

摘要

H9N2亚型流感病毒可引起人以及各种动物低致病性呼吸道疾病。水貂对其易感，由于我国水貂养殖特点为狐狸、貉子与其混合饲养，从而加大了狐狸、貉子感染H9N2亚型流感病毒的机会。
　　为研究H9N2流感病毒在水貂群中的流行及进化情况，以及是否在狐狸和貉子种群中造成感染。2015年本实验室从山东省中东部地区收集到105份水貂、32份狐狸和20份貉子的肺组织,并从水貂肺组织中分离到六株 H9N2亚型流感病毒，A/Mink/Shandong/Z1/2015,A/Mink/Shandong/Z2/2015,A/Mink/Shandong/Z3/2015,A/Mink/Shandong/Z4/2015,A/Mink/Shandong/Z5/2015和A/Mink/Shandong/Z6/2015。而在狐狸和貉子的肺组织中没有分离到流感病毒。
　　将六株分离毒株的核苷酸序列与GenBank中收录的H9N2亚型流感病毒的核苷酸序列进行比对发现，该六株分离毒株的八个基因片段同源性为99.2％～100％；其PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS基因与A/mink/Shangdong/F10/2013(H9N2)(Mk/SD/F10/13)毒株的相应片段同源性最高，都在97.0％以上，而PB2基因与A/environment/Suzhou/14/2013(H7N9)同源性最高，为99.4%。
　　为进一步揭示六株分离毒株的分子特征，用DNASTAR软件分别推导其各基因片段的氨基酸序列，并与参考毒株进行比较分析。分析结果表明，该六株分离毒株八段氨基酸序列的同源性为98.2-100%。六株分离毒株的HA蛋白第226位氨基酸均为亮氨酸(Leu)，具有SAα-2,6-Gal的受体结合特性；其裂解位点处氨基酸序列为RSSR，表明六株病毒均是低致病性的毒株；HA蛋白有8个潜在糖基化位点，与参考毒株相比，在218位氨基酸处丢失了一个潜在的糖基化位点，在313位氨基酸处增加了一个潜在的糖基化位点；六株分离毒株PB2蛋白的氨基酸序列在627位编码谷氨酸Glu，第701位编码天冬酰胺 Asn，第627位符合禽源流感的特点，但第701位的天冬酰胺 Asn可以补偿第627位突变产生的影响，增强其在哺乳动物体内的复制能力。
　　为了进一步分析六株分离毒株的基因片段的起源，用GeneBank中的H9N2亚型流感病毒的序列作为参考序列，进行系统发生分析。HA基因的系统发生树分析得出：六株分离毒株属于欧亚Ⅲ系的Y280亚系分支, NA基因与内部基因PB1、PA、NP、NS的系统发生树分析表明：六株分离毒株属于欧亚Ⅱ系的Shanghai/F/98亚系分支，M基因的系统发生树表明：六株分离毒株属欧亚Ⅱ系的Hong Kong/G1/97亚系分支。且以上7个片段与Mk/SD/F10/13毒株具有最近的亲缘关系；PB2基因的系统发生树分析表明：六株分离毒株属于欧亚Ⅰ系的Korea/38349-p96323/96亚系分支，且与A/environment/Suzhou/14/2013(H7N9)有很近的亲缘关系。
　　为研究貂源H9N2亚型流感病毒能否在水貂种群中水平传播，是否可以跨种传播给狐狸、貉子。本研究用实验室保存的Mk/SD/F10/13毒株进行动物实验。动物实验结果，发现在接种后的第4-8天，哨兵水貂出现了精神沉郁、食欲减退、流清亮鼻涕、流眼泪、轻微的咳嗽等症状，最后攻毒水貂和哨兵水貂都恢复健康，没有造成死亡。排毒检测发现哨兵水貂在第4～6天内能够通过鼻腔向外界排毒。剖检能发现肺脏出血、气管环出血、脾脏肿大出血等病理学变化。组织病理学观察发现肺脏表现出血性间质性肺炎，且肺泡壁充血增厚。第14天采集水貂血液样本分离血清进行HI抗体检测发现HI抗体均为阳性。哨兵狐狸和貉子没有表现临床症状，也没检测到排毒，但第14天采集狐狸和貉子血清检测发现HI抗体均为阳性。同时进行了狐狸和貉子的致病性实验，攻毒狐狸和貉子没有表现临床症状，也没检测到排毒，而第14天采集狐狸和貉子血清检测发现HI抗体也为阳性。这些结果表明：在实验条件下，貂源H9N2亚型流感病毒可以在水貂种群中水平传播，并可以跨种传播给狐狸、貉子。此外，为进一步研究H9N2亚型流感病毒在水貂、狐狸和貉子种群中的流行情况，进行了血清学调查。调查结果：水貂血清中抗H9N2亚型流感病毒的抗体阳性率达为31%（97/313），高于2013年的20%。狐狸血清中抗H9N2亚型流感病毒的抗体阳性率为59.4%（76/128），貉子血清中抗H9N2亚型流感病毒的抗体阳性率为41.4%（106/256）。该结果表明H9N2亚型流感病毒在水貂群中的流行越来越广泛，并在狐狸和貉子群中流行。
　　本研究证实了貂源H9N2亚型流感病毒可以在水貂种群中水平传播，并可以跨种传播给狐狸、貉子。而且在毛皮动物种群中广泛流行。此外，貂源H9N2亚型流感病毒在水貂体内持续进化。这可能会对毛皮动物养殖业造成危害，而且毛皮动物也可能作为H9N2流感病毒的中间宿主而感染其他动物，甚至可能感染人类。本研究对做好H9N2流感病毒的防制和监测工作提供了重要的分子流行病学资料，因而具有重要的公共卫生学意义。

目录

声明

符 号 说 明

前言

1综述

1.1流感病毒的分类和命名

1.2 流感病毒及其生物学特性

1.3 水貂、狐狸、貉子流感病毒的流行病学概述

1.4 H9N2亚型流感病毒的流行病学概述

1.5 本实验研究的目的和意义

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 试验方法

3 结果

3.1 分离毒株各段基因的RT-PCR扩增结果

3.2 分离毒株各段基因的酶切鉴定结果

3.3 分离毒株各段基因的序列分析

3.4 血清学结果

3.5 动物实验结果

4 讨论

5 结论

参考文献

致谢

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