山银花多酚氧化酶及过氧化物酶酶学性质研究

摘要

本研究从山银花的花蕾中分离纯化出多酚氧化酶(PPO)，对多酚氧化酶进行酶学性质表征。经过硫酸铵分级沉淀和DEAE-纤维素离子交换层析柱后，多酚氧化酶纯度达到25.48倍，使用多角度激光光散射法和电泳法测定分子量约为28.8kDa。山银花中PPO以L-dopa为底物时，发生酶促反应的最佳pH值和最适温度分别为8.5和15℃。在热稳定性试验中，多酚氧化酶在10℃、20℃中预处理60min后依然稳定，酶活性保持在90％以上，温度升高稳定性降低。PPO底物专一性具有二元酚和三元酚特性，以L-dopa作为多酚氧化酶反应底物的米氏常数确定为2.26mmol/L。根据Vmax/Km常数的特异性，邻苯二酚为PPO较适底物。此外，抗坏血酸对PPO活性的抑制作用最强，浓度仅为1 mmol/L时，就可以抑制78％以上的PPO酶活性。
　　对山银花中过氧化物酶(POD)进行酶学性质表征。山银花中POD以愈创木酚为底物最适pH值为6.0，最适反应温度较低，仅为15℃，且热稳定性较高，当温度低于50℃时，预处理60min后酶活性变化均不大，在高温条件达到80℃时，发生失活。POD的愈创木酚和H2O2的米氏常数分别为14.33mmol/L、0.2mmol/L。常见的化合物对于POD具有一定的影响作用，其中抗坏血酸对POD的抑制率最强，当浓度为1 mmol/L时，抑制达到90％以上。常见金属离子对过氧化物酶活力也有一定程度的影响。
　　研究不同干燥方法对山银花酶活性及相关活性成分含量的影响，为确定山银花最佳干燥方法，提高山银花品质提供实验依据。采用真空微波干燥、恒温鼓风干燥、阴干对山银花样品进行干燥处理;利用分光光度计法测定样品多酚氧化酶、过氧化物酶的酶活性以及总酚、总黄酮含量;利用高效液相色谱法测定绿原酸及木犀草苷的含量。真空微波处理的山银花样品，多酚氧化酶及过氧化物酶酶活性最低，剩余酶活性仅为鲜样的30％和13％，产生轻微褐变，总酚、总黄酮、绿原酸、木犀草苷含量最高;阴干样品大部分酶活性仍保留，褐变严重，活性成分含量最低。因此，不同干燥方法对山银花酶活性及活性成分有较大影响，真空微波干燥为最佳干燥方法。