金银花中多酚氧化酶和过氧化物酶的分离纯化及特性研究

摘要

本研究以山东亚特良种金银花为原料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE纤维素-52离子交换柱分离纯化金银花中PPO和POD,并分别对这两种酶的分子量和特性进行了研究,包括温度和pH值对酶活性的影响,酶活性对温度和pH值的稳定性,底物的专一性,金属离子及抑制剂对酶活性的影响,为金银花贮藏和加工过程中的酶促褐变的抑制提供科学依据。通过分析,主要研究结果如下:
　　1、通过硫酸铵分级沉淀和离子交换层析,金银花PPO纯化倍数为30.76,回收率33.8％,分子量约为49kDa。金银花POD纯化倍数28.95,回收率17.52,变性分子量约为20.4kDa。
　　2、金银花PPO粗酶液最适反应温度为30℃;20℃、30℃加热60min剩余相对酶活力分别为80%和53%;40℃、50℃加热60min后相对残余酶活力低于40%;60℃处理60min相对残余酶活力为10%;70℃时酶活力几乎完全丧失。金银花PPO最适反应pH值为7.5,在pH值7.5~9.5较稳定,相对残余酶活力大于90%。金银花POD粗酶液最适反应温度为30℃;20℃、30℃加热60min残余酶活力在90%以上,60℃处理60min相对残余酶活力小于10%;金银花POD最适反应pH值为5.5,在pH值8.0时较稳定。
　　3、金银花PPO属于双酚氧化酶,可以氧化临位双酚(邻苯二酚、L-dopa、绿原酸),不能氧化单酚(L-tyrosine)和三酚(没食子酸、焦性没食子酸、甲基没食子酸)。金银花POD具有广泛的底物特性,在H2O2条件下可以氧化酚类和芳香胺类化合物(愈创木酚、邻苯二酚、阿魏酸、咖啡酸、绿原酸、焦性没食子酸、邻联茴香胺、联苯胺)。
　　4、金属离子Na+、K+对金银花PPO酶活力没有影响;Mn2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+有激活作用;Cu2+、Co2+表现为抑制作用。SDS对PPO活力有激活作用;亚硫酸钠、柠檬酸、抗坏血酸、曲酸和托酚酮对PPO有不同程度的抑制作用。金属离子Na+对金银花POD酶活力没有影响;Ca2+、Zn2+有激活作用,而K+、Mn2+、Mg2+表现为抑制作用;抑制剂(柠檬酸、抗坏血酸、曲酸、托酚酮、DTT,等)及表面活性剂(SDS、TritonX-100、Tween-80)对金银花POD均有一定的抑制作用。

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1 文献综述

1.1 金银花

1.2 酶促褐变的研究

2 引言

2.1 课题提出的依据及研究意义

2.2 课题研究内容和目标

3 试验材料

3.1 试验材料、仪器与试剂

4 试验内容与方法

4.1 PPO提取纯化与特性研究

4.2 POD提取纯化及特性研究

4.3 不同花期活性成分含量测定

4.4 试验方法

5 结果与分析

5.1 PPO粗酶液的性质及分离纯化

5.2 POD粗酶液的性质及分离纯化

5.3 金银花最佳采收期的确定

6 结论与讨论

6.1结论

6.2讨论

参考文献

致谢

作者简介

攻读硕士学位期间发表的论文