中国小麦花叶病毒全基因组序列分析及CP、CRP蛋白的蛋核表达和抗血清制备

摘要

中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus，CWMV)属于帚状病毒科（Virgaviridae）真菌传杆状病毒属（Furovirus），由禾谷多黏菌（Polymyxa gramins）传播。其基因组为两条正单链RNA，包装在不同的粒子内。CWMV在我国山东烟台、威海等地发生普遍，严重威胁小麦的产量和质量。
　　为了明确CWMV的进化规律和致病机理，本研究测定了CWMV烟台分离物与临沂分离物的全基因组序列，分析了CWMV的遗传进化特点，并利用原核表达的衣壳蛋白及富含半胱氨酸蛋白分别制备了特异性抗血清;同时，获得了CWMV RNA2的侵染性克隆载体。本文的主要研究内容如下:
　　1、扩增获得CWMV烟台与临沂分离物的全基因组序列。经分析发现其RNA1为7147nt，RNA2分别为3563 nt和3564 nt，RNA1与RNA2均含有3个开放阅读框。在利用RNA1、RNA2全基因及其ORF序列构建的系统进化树中，CWMV均分为两个组(Ⅰ和Ⅱ)。烟台分离物RNA1、RNA2及其ORF均被聚类到Ⅰ组，临沂分离物除CP外均聚类到Ⅱ组，CP聚类到了Ⅰ组。我们通过RDP4软件进行重组分析，发现CWMV临沂分离物RNA2的CP区域发生了重组。
　　2、利用原核表达的衣壳蛋白及富含半胱氨酸蛋白制备了特异性抗血清。采用RT-PCR方法克隆CWMV烟台分离物的外壳蛋白及富含半胱氨酸蛋白基因，并将其连接到原核表达载体pEHISTEV，转化大肠杆菌Rosetta。经IPTG诱导，产生了分子量均为19 kDa的CP和CRP。将二者从凝胶中切下，经乳化后免疫新西兰大耳兔4次，获得了CWMV CP及CRP的多克隆抗体。ELISA检测结果表明，CWMV CP和CRP抗血清的效价分别为1∶4096和为1∶2048。Western Blot分析表明，该抗血清能与CWMV侵染的小麦发生特异性反应，而与健康小麦或小麦黄花叶病毒侵染的小麦均无反应。
　　3、获得了CWMV RNA2的侵染性克隆载体。利用含T3启动子的引物通过RT-PCR扩增CWMV RNA2全长片段，经T/A克隆连接到pMD18-T，获得质粒pMD18-T-CWMV-RNA2。该质粒经XbaⅠ线性化后，利用T3 RNA聚合酶进行体外转录，转录产物摩擦接种本氏烟，15℃培养3天后，利用Western blot可从接种叶片中检测到瞬时表达的CWMV衣壳蛋白。

目录

声明

缩略词表

摘要

1．前言

1．1 中国小麦花叶病毒研究进展

1．1．1 分布及危害

1．1．2 田间症状

1．1．3 分类地位

1．1．4 基因组结构

1．1．5 蛋白功能

1．1．6 传播介体

1．1．7 侵染循环

1．1．8 防治措施

1．2 植物病毒侵染性克隆

1．3 植物病毒的遗传和进化分析

1．3．1 病毒的变异机制

1．3．2 突变

1．3．3 重组

1．3．4 重排

1．3．5 序列分析

1．5 本研究目的与意义

2．材料与方法

2．1 试验材料

2．1．1 植物材料

2．1．2 菌株、质粒

2．1．3 酶与试剂

2．1．4 寡聚核苷酸引物

2．1．5 主要实验仪器

2．2 试验方法

2．2．1 CWMV全基因组序列的测定

2．2．2 CWMV序列分析

2．2．3 CWMVCP与CRP蛋白的原核表达

2．2．4 抗血清制备

2．2．5 CWMV RNA2侵染性克隆的构建

3．结果与分析

3．1 CWMV烟台、临沂分离物的全基因组序列分析

3．1．1 CWMV核苷酸序列及基因组分析

3．1．2 与其他CWMV分离物的一致率比对

3．1．3 系统发育关系

3．1．4 重组分析

3．2 CWMV CP与CRP蛋白的原核表达、抗血清制备

3．2．1 CWMV CP基因及CRP基因克隆与测序分析

3．2．2 CWMV CP与CRP蛋白的诱导表达和SDS-PAGE分析

3．2．3 抗血清的制备与特异性检测

3．2．4 抗血清效价测定

3．2．5 CWMV RNA2体外转录实验

4．讨论

4．1 CWMV种群结构分析

4．2 抗血清制备与应用

5．结论

参考文献

致谢

附录