自噬在小鼠卵母细胞老化中作用的初步研究

摘要

卵母细胞老化过程中氧自由基累积导致线粒体、内质网等细胞器功能受损，细胞内Ca2+平衡失调，MPF活性下降，卵母细胞的激活敏感性升高，胚胎发育能力下降。自噬是吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。研究发现自噬是胚胎发育所必需的，并且在卵母细胞体外成熟期间激活自噬能够提高胚胎发育能力，但卵母细胞老化过程中自噬的变化及作用研究较少。因此我们以小鼠为模型，研究体内成熟卵母细胞在体内和体外老化过程中自噬的变化规律，以及自噬对卵母细胞老化和发育的影响。结果如下:
　　1、小鼠卵母细胞体内老化12h后自噬降低，老化24h后自噬不再下降。
　　2、小鼠卵母细胞体外老化12h期间在H2O2条件培养基中培养，与对照组相比自噬下降;添加MG132组自噬则高于对照组。
　　3、小鼠卵母细胞体外老化12h期间，添加自噬激活剂Rapamycin，自噬增加，激活率下降，胚胎发育能力升高;而添加自噬抑制剂3-MA，自噬下降，激活率增加，胚胎发育能力降低。
　　4、小鼠卵母细胞体外老化12h后自噬降低，老化24h后自噬不再下降。
　　5、小鼠卵母细胞体外老化0h时或老化24h时添加3-MA，降低卵母细胞碎裂率;而在卵母细胞老化12h或24h期间添加3-MA，不影响卵母细胞碎裂。
　　6、小鼠卵母细胞体外老化期间，添加Rapamycin，不影响卵母细胞碎裂。
　　总之，卵母细胞无论在体内还是在体外老化过程中自噬下降，老化24h后自噬不再下降。卵母细胞体外老化12h期间，激活自噬，降低激活率，提高发育能力;抑制自噬，增加激活率，降低发育能力。自噬不影响卵母细胞碎裂。

目录

声明

符号说明

摘要

1 前言

1．1 卵母细胞老化的特征

1．1．1 卵母细胞老化对皮质颗粒(CGs)的影响

1．1．2 卵母细胞老化对纺锤体的影响

1．1．3 卵母细胞老化对微管的影响

1．1．4 卵母细胞老化对染色体的影响

1．2 卵母细胞老化的机理

1．2．1 卵丘细胞加速卵母细胞老化

1．2．2 MPF和MAPK调控卵母细胞老化

1．2．3 线粒体功能异常影响卵母细胞老化

1．2．4 异常Ca2+升高导致细胞凋亡

1．2．5 氧化应激导致卵母细胞老化

1．3 自噬

1．3．1 自噬的发生

1．3．2 自噬发生的分子机制

1．3．3 自噬的分子调控

1．4 自噬与细胞及年龄老化

1．5 自噬与胚胎发育

1．6 研究的目的及意义

2．材料与方法

2．1 主要试剂及配制

2．2 实验动物及超排处理

2．3 体内成熟卵母细胞的获取

2．4 裸卵制备

2．5 DOs的体外老化

2．6 卵母细胞乙醇联合6-DMAP孤雌激活

2．7 卵母细胞乙醇孤雌激活

2．8 SrCl2激活处理

2．9 卵母细胞激活的判定

2．10 LC3Ⅱ免疫荧光染色及定量分析

2．11 LC3Ⅱ Western Blot定量分析

2．11．1 Western blot相关试剂的制备

2．11．2 细胞LC3蛋白样品的制备

2．11．3 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．11．4 抗原抗体的结合及显色

2．12 卵丘细胞培养与H2O2条件培养基(H2O2CM)制备

2．13 数据统计

3．结果与分析

3．1 小鼠卵母细胞体内老化期间自噬的变化规律

3．2 不同体外老化培养体系与自噬的关系

3．3 添加RAPA／3-MA对卵母细胞激活率的影响

3．4 添加RAPA／3-MA对卵母细胞孤雌发育的影响

3．5 添加RAPA／3-MA对卵母细胞碎裂的影响

3．6 添加RAPA／3-MA对LC3Ⅱ表达量的影响

3．7 3-MA不同时间段抑制培养对卵母细胞碎裂的影响

4．讨论

5．结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况