自噬在小鼠卵母细胞老化中的作用——用氯化锂调控自噬活动的研究

摘要

哺乳动物卵母细胞在排卵后会阻滞在第二次减数分裂中期，如果没有在最佳的时间窗口内完成受精过程，卵母细胞将发生老化过程。卵母细胞的老化不仅能够导致妊娠率降低、流产率增加及出生缺陷的增加，而且也是引起异常受精、异常卵裂、受精后胚胎非整倍体率增加的主要原因。同时，老化卵母细胞的后代也会表现出精神异常、好动性增加、繁殖力低下以及寿命缩短等现象。延缓或阻止卵母细胞的老化已成为哺乳动物繁殖和胚胎工程所急需解决的问题。在延缓或阻止卵母细胞老化的研究中，自噬已经成为当前研究的热点之一。 前期的实验是在卵母细胞体外老化过程中添加自噬激活剂雷帕霉素（RAPA）和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA），实验结果已证明自噬在阻止或延缓卵母细胞老化方面起着重要的作用。自噬激活剂RAPA是通过作用于mTOR通路来激活自噬，是否还存在另外一种自噬激活剂，不通过mTOR通路也可以激活自噬来抑制小鼠卵母细胞老化？针对这个问题的研究还尚未有报道出现，本实验主要探究在卵母细胞体外老化过程中添加氯化锂（LiCl，一种非mTOR通路的自噬激活剂），是否可以起到延缓或阻止卵母细胞老化的作用。 为此，首先在前期实验的基础上将卵母细胞体外老化不同时间（0h、12h、18h），研究体外老化过程中自噬与凋亡之间存在的关系，然后在体外老化的前期阶段（体外老化12h），在培养液中添加非mTOR通路的自噬激活剂氯化锂调节自噬活性，检测非mTOR通路的自噬激活剂氯化锂激活自噬后对一系列老化指标的影响以及自噬在老化后期对缓解老化损伤的作用，以期为延缓或阻止卵母细胞老化提供理论依据。 实验结果表明： （1）在小鼠卵母细胞体外老化的早期阶段（即体外老化12h），自噬作为一个适应性反应出现来阻止进一步的细胞凋亡，这一阶段在培养基中添加非mTOR通路的自噬激活剂氯化锂激活自噬时，老化情况明显得到改善，表现为胞质钙浓度（0.6vs0.46）、P62表达水平（1.07vs0.71），氧化应激水平（46.71vs31.04）、caspase-3表达水平（100vs70.13）及不同时间点碎裂率（36h、48h、60h、72h、84h）均下降，而发育能力（37.18vs50.42）、LC3-II表达水平（2.49vs3.17）、线粒体膜电位（0.36vs0.57）、正常纺锤体比例及正常分布的皮质颗粒比例均增加。 （2）在小鼠卵母细胞体外老化的晚期阶段，由于与凋亡相关的caspase-3蛋白的逐渐激活，会阻断自噬进程，从而使卵母细胞表现出更为严重的凋亡，此时再添加自噬激活剂LiCl，自噬进程已无法被激活，自噬也不再发挥作用。

目录

声明

符号说明

1前言

1.1卵母细胞老化

1.1.1卵母细胞老化的定义

1.1.2卵母细胞老化的后果

1.1.3卵母细胞老化的指标

1.2自噬

1.2.1自噬的概述

1.2.2自噬发生过程

1.2.3自噬调节机制

1.2.4自噬相关蛋白

1.2.5自噬与细胞凋亡

1.2.6自噬与氧化应激

1.2.7调控自噬活性的药物

1.3卵母细胞老化和自噬的关系

1.4研究目的与内容

2材料与方法

2.1实验材料

2.1.1主要试剂及配置

2.1.2主要仪器设备

2.2实验方法

2.2.1小鼠的超排处理

2.2.2卵母细胞获取

2.2.3条件培养基制备

2.2.4免疫荧光染色

2.2.5蛋白质杂交（Western Blot）

2.2.6卵母细胞酒精联合6-DMAP激活

2.2.7卵母细胞氯化锶激活

2.2.8卵母细胞激活的判定

2.2.9胚胎培养

2.2.10 卵母细胞内活性氧物质的检测

2.2.11 卵母细胞内钙离子储量的检测

2.2.12 JC-1 染色方法

2.2.13 纺锤体（α-微管）染色

2.2.14 皮质颗粒染色

2.2.15 卵母细胞碎裂的判定

2.2.16 数据统计

3结果与分析

3.1老化卵母细胞中自噬与凋亡关系的研究

3.1.1卵母细胞在FCM培养基中老化不同时间的自噬体表达水平

3.1.2卵母细胞在FCM培养基中老化不同时间的自噬蛋白的免疫荧光染色

3.1.3卵母细胞在FCM培养基中老化不同时间的凋亡蛋白caspase-3表达水平

3.2氯化锂浓度的选择

3.3卵母细胞在不同培养基中老化12h后自噬蛋白表达量检测

3.4体外添加LiCl提高自噬活性对老化指标的影响

3.4.1添加LiCl对卵母细胞Caspase-3表达量的影响

3.4.2添加LiCl调节自噬对卵母细胞发育能力的影响

3.4.3添加LiCl调节自噬对卵母细胞胞质钙离子浓度的影响

3.4.4添加LiCl调节自噬对小鼠老化卵母细胞ROS水平的影响

3.4.5添加LiCl调节自噬对小鼠老化卵母细胞线粒体膜电位的影响

3.4.6添加LiCl调节自噬对小鼠老化卵母细胞纺锤体的影响

3.4.7添加LiCl调节自噬对小鼠老化卵母细胞皮质颗粒迁移的影响

3.4.8添加LiCl调节自噬对小鼠老化卵母细胞碎裂率的影响

3.5老化12h后再添加LiCl调节自噬对老化卵母细胞激活敏感性的影响

4讨论

4.1老化卵母细胞中自噬与凋亡关系的研究

4.2自噬活性标志物的选择

4.3自噬激活剂的选择

4.4氯化锂增加自噬活性对主要老化指标的影响

4.5自噬在老化晚期的作用

5结论

6参考文献

7致谢

8攻读学位期间发表论文情况