不同分子生物学方法用于检测鸡传染性贫血病毒时的比较研究

摘要

鸡传染性贫血病是鸡群中流行最为普遍的一种免疫抑制病，是由鸡传染性贫血病毒（Chicken infectious anaemia virus，CIAV）引起的临床上以贫血、全身淋巴组织萎缩、骨髓黄染和免疫机能损害为主要特征的一种传染病。近年来在世界上诸多地方普遍出现了家禽感染CIAV的现象，给鸡群和养禽业造成了极大的危害。目前CIAV已在各种不同鸡群中广泛地传播，甚至在某些SPF鸡群中也检测到CIAV的存在。CIAV除了垂直传播和水平传播以外，使用了被CIAV污染的弱毒疫苗是其另一重要的传播途径。因此对于鸡群日常使用的疫苗进行外源病毒污染的检测变得尤为重要，而通常疫苗中污染的CIAV剂量较低，需要使用灵敏特异而又快速简便的方法来检测，所以利用各种方法加强对禽弱毒疫苗中CIAV污染的监测对于CIAV的防控非常重要。本研究建立了针对CIAV的微滴式数字PCR（dd-PCR）方法用于弱毒疫苗中CIAV污染的检测，通过使用不同核酸检测方法针对大批量不同批次的疫苗和病料样品进行CIAV的检测，对不同方法的灵敏度做了对比。 为了解我国不同鸡群中CIAV的感染情况以及禽用弱毒疫苗中CIAV的污染情况，本研究利用常规PCR、Nested-PCR、PCR结合核酸斑点杂交和实时荧光定量PCR等不同核酸检测方法对近两年企业送检的11批次525份临床病料以及13批次125份疫苗样品进行了检测。结果显示，四种方法中Nested-PCR灵敏度最高，从送检的病料样品中检测出CIAV阳性率为11.2％（59/525），疫苗样品中检测出CIAV阳性率为4.8％（6/125）， PCR结合核酸斑点杂交和实时荧光定量PCR与Nested-PCR检出率基本一致，但常规PCR检出率明显低于上述三种方法。本研究调查结果不仅进一步显示了CIAV感染的普遍性和某些禽用弱毒疫苗中CIAV污染的存在，也对不同方法在CIAV检测中的应用做了系统分析和比较。 为了更灵敏的检测禽弱毒疫苗中CIAV的污染，本研究根据GenBank已登录的CIAV基因序列，设计并合成了针对CIAV特异性引物和探针，探针以 FAM 为荧光报告基团，以BHQ为荧光淬灭基团针对其保守区设计了外用引物和内用引物，对反应体系和反应条件进行优化，建立了检测CIAV的微滴式数字PCR方法。结果显示，该方法特异性强灵敏度高，比常规PCR灵敏度高约1000倍。此种检测方法与禽网状内皮组织增生症病毒、鸡马立克氏病毒和禽白血病病毒等病毒基因均不会产生交叉反应，具有良好的特异性。在模拟试验中，该方法可以检测到1000羽份弱毒疫苗中0.1个EID50的CIAV污染，不仅灵敏度最高，而且判断非常直观，特别适用于疫苗中CIAV污染的检测，实现了疫苗中外源病毒污染检测灵敏度大幅度的提升和飞跃，为不同实验条件和技术水平的企业提供了更多实用性的选择。

目录

声明

符号说明

前言

1.1鸡传染性贫血病毒（CIAV）病原学

1.2鸡传染性贫血病毒（CIAV）流行病学

1.3 鸡传染性贫血病毒（CIAV）发病机理

1.4 鸡传染性贫血病毒（CIAV）病理变化

1.5 CIAV疫苗研究进展

1.6 CIAV的诊断技术

2 材料与方法

2.1 材料

2.2 方法

结果与分析

3.1重组质粒标准品的制备

3.2不同核酸检测方法用于CIAV检测时的比较

3.3 CIAV微滴式数字PCR方法的建立及应用

讨论

4.1 不同核酸检测方法用于鸡传染性贫血病毒检测时的比较

4.2 鸡传染性贫血病毒微滴式数字PCR检测方法的建立及应用

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间发表论文情况