c/EBPβ对淀粉样前体蛋白基因表达调控作用的研究

摘要

目的：
　　阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是最常见的神经系统退行性疾病，而AD的一个明显病理特征是β样淀粉多肽(amyloidβ,Aβ)在神经组织的沉积。Aβ来源于淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)的异常裂解。CCAAT-增强子结合蛋白β(CCAAT enhancer binding proteinsβ,c/EBPβ)是转录因子c/EBPs家族的重要成员，对基因的表达调控起着重要的作用。本研究旨在探讨转录因子c/EBPβ对APP基因启动子转录活性的影响及其对APP基因表达调控的作用机制，进一步探讨c/EBPβ在AD发病过程中的作用，为AD的预防和治疗提供新的思路。
　　方法：
　　1.载体构建：利用分子克隆技术，构建pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒载体和pCDNA3.1-Sp1真核表达载体。
　　2.萤火虫荧光素酶报告基因检测实验(Luciferase assay)：将c/EBPβ真核表达载体pCDNA3-c/EBPβ与萤火虫荧光素酶报告质粒pGL3APP170/147共转染到U87MG细胞中，用Renilla作为内参，通过对萤火虫荧光素酶活性的分析，确定c/EBPβ蛋白对APP基因启动子活性的影响。
　　3.实时定量荧光PCR(Real Time PCR,RT-PCR)：用Trizol法提取用c/EBPβ慢病毒和用作对照的空载体病毒感染的HT22细胞的总RNA，进行反转录，然后再合成cDNA后进行real-time PCR，检测c/EBPβ、APP和Sp1基因在转录水平上的表达。
　　4.蛋白免疫印迹实验(Western blotting)：提取用c/EBPβ慢病毒和用作对照的空载体病毒感染的HT22细胞的总蛋白，进行常规蛋白免疫印渍实验，检测c/EBPβ、APP、Sp1及P65蛋白在翻译水平上的表达。
　　5.免疫共沉淀实验(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)：将真核表达载体c/EBPβ和P300共同转染到HT22细胞中，48小时后收获细胞总蛋白，进行免疫共沉淀，确定c/EBPβ蛋白和P300蛋白之间是否有直接的相互作用(physical interaction)。
　　结果：
　　1.载体构建结果：pCDH-EF1-MCS-T2A-copGFP-c/EBPβ慢病毒载体和pCDNA3.1-SP1真核表达载体经酶切鉴定和测序后，证实所克隆序列及相位完全正确。
　　2.Luciferase assay实验结果：c/EBPβ蛋白可上调APP基因启动子（-170到+147）的活性。
　　3.RT-PCR结果：c/EBPβ过表达组的c/EBPβ、APP和Sp1的RNA表达水平均高于空载对照组的。
　　4.Western blotting实验结果：c/EBPβ过表达组的c/EBPβ、APP、Sp1和P65的蛋白表达水平均高于空载对照组的。
　　5.Co-IP实验结果：c/EBPβ蛋白和P300蛋白之间有直接的相互作用。
　　结论：c/EBPβ对APP基因在转录和翻译水平具有上调作用。其作用机制可能有：
　　1.c/EBPβ作为一个转录因子，可以调控基因的表达，它对APP基因表达调控的作用机制可能在于其能促进内源性Sp1基因的表达，而Sp1则是APP基因表达的上调因子，它可与启动子近端GC盒的结合，促进了APP基因的转录和表达，c/EBPβ和Sp1在基因表达调控方面有着协同作用。
　　2.c/EBPβ过表达也能引起细胞内P65的表达水平显著增加，于是，我们推测c/EBPβ极有可能激活NF-κB通路从而影响下游因子，实现对APP基因表达的调控作用。
　　3.c/EBPβ蛋白和P300蛋白之间存在着相互作用，我们推测c/EBPβ蛋白和P300蛋白可形成转录复合物，从而实现对APP基因表达的调控作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

中英文缩略词表

目录

前言

材料

1.材料

实验方法

2.试验方法与步骤

3.统计方法

实验结果

1.构建质粒实验结果

2.萤火虫荧光素酶报告基因实验结果

3. 实时定量荧光PCR实验 (RT-PCR) 结果

4.蛋白免疫印迹

5. c/EBPβ过表达对Sp1基因表达的影响

6. c/EBPβ过表达对P65基因表达的影响

7. c/EBPβ和P300蛋白的相互作用

讨论

结论

参考文献

综述:转录因子CCAAT增强子结合蛋白β(c/EBP β)的研究进展

致谢

攻读硕士研究生期间发表的文章

个人简历