骨髓间充质干细胞移植联合促红细胞生成素治疗下肢动脉缺血性疾病的实验研究

摘要

研究背景：
　　 成体干细胞移植是治疗性血管新生的另一策略。用于移植的细胞主要包括EPCs、BM-MNCs、PBSCs、MSCs等。目前临床上最常用的是自体BM-MNCs移植。BM-MNCs中含有EPCs，EPCs可以分化为血管内皮细胞，形成新生的血管，在出生后的血管发生中起重要作用。BM-MNCs还可以分泌多种细胞因子促进血管新生。实验和临床研究都表明BM-MNCs移植可以改善下肢动脉缺血。但是，也有研究显示干细胞移植的治疗效果和移植细胞数量有关，而EPCs在骨髓和外周血中的数量极少，并且在糖尿病、高胆固醇血症、高胱氨酸血症、尿毒症、老龄等病人体内EPCs的数量和功能都较正常人低下。在这些病人中有时难以采集到足够的、高质量的BM-MNCs而导致治疗效果不佳。而骨髓MSCs不仅可以通过分化为血管内皮细胞和分泌多种细胞因子促进血管新生，而且可以由体外扩增得到大量高质量的干细胞，没有免疫原性，可以进行同种异体移植，与BM-MNCs相比，骨髓MSCs有可能会成为一种更好的治疗下肢动脉缺血性疾病的移植细胞来源。Kinnaird等发现MSCs促血管新生的效果和其数量有关，但是增加MSCs的数量并不能无限制的增加MSCs的治疗效果。还有研究发现缺血刺激会导致移植后的MSCs大量凋亡，数量锐减，导致其治疗效果明显下降。联合其他治疗措施以进一步增加MSCs的治疗效果具有重要的意义。
　　 本课题分三部分，依次探讨以下问题：(1)评价自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的疗效并分析其影响因素。(2)研究骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、扩增以及鉴定方法，观察骨髓间充质干细胞的生物学特性以及4'，6二脒基-2-苯基吲哚标记的效果。(3)制备大鼠下肢缺血模型，研究联合应用EPO是否可以增强MSCs移植治疗下肢动脉缺血性疾病的效果，并且探讨其可能的机制。
　　 第一部分：自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的疗效观察及影响因素分析
　　 目的：评价自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的疗效并分析其影响因素。
　　 方法：26例符合自体BM-MNCs移植的下肢动脉缺血性疾病患者，均于局部麻醉下抽取自体骨髓血，使用密度梯度离心法提取BM-MNCs，行缺血下肢局部肌肉注射。移植术后3个月，观察患肢疼痛、冷感、间歇性跛行距离等变化，进行临床主观指标评分、测量踝肱指数(ankle-brachial index，ABI)、患肢血流速度峰值，与BM-MNCs移植前比较，评价BM-MNCs移植治疗效果。并且根据BM-MNCs移植浓度，将患者分为高浓度移植组(大于1×107个/ml)和低浓度移植组(小于1×107个/ml)，比较两组移植前后缺血改善程度，评价BM-MNCs移植浓度对治疗效果的影响。
　　 结果：BM-MNCs移植后3个月，患者疼痛、冷感、间歇性跛行缓解率分别是92％、84％和88％，各项临床主观指标评分明显低于移植前评分(P＜0.01)，ABI和患肢血流峰值速度较移植前明显增加(0.33±0.22 vs0.24±0.17)(P＜0.01)，(26.65+7.31 vs18.32+5.74)(P＜0.05)。高浓度移植组的疼痛、冷感和间歇性跛行临床主观指标评分差值明显大于低浓度组(P＜0.01)，血流峰值速度差值明显大于低浓度组(5.24±2.34 vs4.39±2.65)(P＜0.05)，有统计学意义。ABI差值大于低浓度组(0.094±0.093 vs0.078±0.063)，但是没有统计学意义(P＞0.05)。随访期间所有病人未见明显并发症。
　　 结论：采用自体BM-MNCs移植治疗下肢动脉缺血性疾病是安全、有效的。BM-MNCs提取的数量、动脉病变的范围，尤其是BM-MNCs移植浓度对于其治疗效果有重要影响。
　　 第二部分：大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性观察
　　 目的：研究骨髓间充质干细胞的分离、体外培养、扩增以及鉴定方法，观察骨髓间充质干细胞的生物学特性以及4'，6二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)标记的效果。
　　 方法：使用骨髓腔冲洗法采集大鼠骨髓血，通过密度梯度离心结合贴壁筛选法得到纯化的MSCs，在含有10％胎牛血清的低糖DMEM培养液中继续培养扩增MSCs。通过细胞形态、贴壁生长特性、流式细胞仪检测细胞CD29、CD44、CD11b、CD45的表达，对培养的MSCs进行鉴定。观察MSCs的细胞形态、生长速度、绘制MSCs的生长曲线、测定MSCs克隆形成率，冻存复苏MSCs后观察其存活率和生长状态。观察DAPI标记MSCs的效率和对MSCs生长状态的影响。
　　 结果：使用密度梯度离心结合贴壁筛选法可以得到高纯度的MSCs，MSCs可以通过体外培养大量扩增。通过本方法培养的MSCs贴壁生长，呈典型的梭形形状，漩涡状排列。流式细胞仪检测细胞表型CD29、CD44表达阳性，CD11b、CD45表达阴性，符合MSCs的特征。观察细胞生长特性发现：MSCs呈贴壁生长，原代培养9～12d可以达到90％融合，传代后的MSCs增殖速度较原代培养明显增快，第3代的MSCs已基本纯化。随着传代的增加，体外培养的MSCs生长增殖能力逐渐减弱，克隆形成率逐渐降低。冻存1个月和6个月后复苏的MSCs生存率分别为90％和85％，复苏后的细胞生长状态良好。DAPI标记MSCs的有效率为100％，标记48h后荧光显色无明显减弱，DAPI标记的MSCs的细胞形态和生长状态无明显变化。
　　 结论：密度梯度离心结合贴壁筛选法可以有效的获得纯化的MSCs，体外扩增MSCs是可行的。冻存对MSCs生长特性无明显影响。DAPI可以有效的标记MSCs细胞核，并且对MSCs的形态和生长状态无明显影响。
　　 第三部分：骨髓间充质干细胞移植联合促红细胞生成素治疗下肢动脉缺血性疾病的实验研究
　　 目的：骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)移植是近年来出现的治疗严重缺血性疾病的新方法，促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)能够促进血管新生和抑制MSCs凋亡，本实验研究联合应用EPO是否可以增强MSCs移植治疗下肢动脉缺血性疾病的效果，并且探讨其可能的机制。
　　 方法：Wistar大鼠32只，结扎右侧股动脉及其分支，制备成大鼠下肢动脉缺血模型，并随机分为四组，每组8只，分别是对照组、MSC组、EPO组和MSC+EPO组。股动脉结扎术后24h，MSC+EPO组大鼠给予含有MSCs(1×107cells)和EPO(1000U/kg)的DMEM0.4ml注射于患肢缺血肌肉组织中，MSC组大鼠同法注射仅含MSCs的DMEM，对照组和EPO组的大鼠仅注射DMEM。
　　 EPO+MSC组和EPO组大鼠于股动脉结扎术后24h开始腹部皮下注射含有EPO(1000U/kg·d)的生理盐水0.4ml，每周前3d注射，每天1次，连续3周。其他组仅注射生理盐水。股动脉结扎术后第22d，行激光多谱勒血流灌注成像(laserDoppler perfusion imaging，LDPI)检查患肢血流灌注恢复情况、微血管造影检测侧枝血管形成情况，抗FVIII因子相关抗原多克隆抗体、抗αSMA抗体免疫组织化学染色，显示血管内皮细胞和血管平滑肌细胞，检查血管密度和血管面积。免疫荧光双染检查MSCs在体内向血管内皮细胞和血管平滑肌细胞的转化。免疫组织化学染色检查Bax、Bcl-2、VEGF在组织中的表达。RT-PCR检查VEGF mRNA表达。
　　 结果：LDPI检查显示MSC组和EPO组血流灌注明显强于对照组(P＜0.01)，MSC+EPO组最强(P＜0.01)。微血管造影显示对照组侧支血管建立最差，MSC组和EPO组较丰富，MSC+EPO组最丰富，MSC组、EPO组和MSC+EPO组造影评分明显高于对照组(P＜0.01)，MSC+EPO组造影评分最高(P＜0.05)。免疫组化显示MSC组、EPO组、MSC+EPO组血管密度较对照组明显增加(P＜0.05)，尤以MSC+EPO组最为显著(P＜0.05)，大多数新生的血管是无血管平滑肌的微血管，其血管面积在各组间无明显差异(P＞0.05)。少部分新生血管是有平滑肌的微血管，这部分血管在数量上各组之间没有显著性差异(P＞0.05)，其血管面积，MSC组明显高于对照组(P＜0.05)，MSC+EPO组明显高于MSC组(P＜0.05)，EPO组与对照组无明显差异(P＞0.05)。免疫荧光双染显示移植的MSCs可以在体内存活，并且分化为血管内皮细胞和血管平滑肌细胞。免疫组织化学染色和计算机图像分析显示MSC+EPO组较其他组Bcl-2明显上调，Bax明显下调，VEGF蛋白表达更强(P＜0.05)。RT-PCR检查显示MSC+EPO组VEGF mRNA表达最强，其次是MSC组和EPO组，对照组最低(P＜0.05)。
　　 结论：单独应用MSC移植或者EPO注射可以明显促进血管新生、侧枝血管形成和增加缺血组织的血流灌注。联合应用EPO可以明显增强MSC移植治疗下肢动脉缺血的效果。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：符号列表

声明

第一部分自体骨髓单个核细胞移植治疗下肢动脉缺血性疾病的疗效观察及影响因素分析

前言

临床资料

结果

讨论

参考文献

第二部分 大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养及生物学特性观察

前言

材料与方法

结果

讨论

附图表

参考文献

第三部分骨髓间充质干细胞移植联合促红细胞生成素治疗下肢动脉缺血性疾病的实验研究

前言

材料与方法

结果

讨论

附图表

参考文献

综述 治疗性血管新生与下肢动脉缺血性疾病的研究进展

致谢

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