固定化原生质体转化合成L-半胱氨酸的研究

摘要

L-半胱氨酸是一种重要的含硫氨基酸，广泛应用于医药、食品、化妆品以及饲料工业。本试验筛选获得一株假单胞菌SDN625，可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸。本研究从SDN625菌株的原生质体制备和诱变筛选、原生质体固定化、酶法连续转化、L-半胱氨酸产物的分离纯化、分析方法研究、产物鉴定等方面进行了研究，研究结果如下：
　　 从山东新时代药业有限公司污水处理中心的活性污泥中筛选到一株可转化DL-ATC合成L-半胱氨酸的菌株，命名为SDN625，培养48 h后的细胞合成L-半胱氨酸的酶活可以达到3443 U/mL。将培养18 h的细胞收集后加入终浓度为2mg/mL的溶菌酶，在37℃酶解1 h，原生质体形成率可以达到87.3％，形成的原生质体加入浓度为50μg/mL诱变剂NTG，28℃轻微振荡30min后经过再生和筛选，筛选出一株合成L-半胱氨酸的酶活可达到4492 U/mL的菌株，比原始菌株SDN625酶活最高值提高30.5％，命名为SDN625-1。
　　 使用海藻酸钙和聚丙烯酰胺两种固定化方式对菌株SDN625-1的原生质体固定化，结果发现海藻酸钙固定化明显优于聚丙烯酰胺。利用海藻酸钙进行固定化时，培养28 h收获细胞，加入终浓度为2 mg/mL的溶菌酶，37℃保温4 h，固定化粒子的细胞密度调节为1×108个/mL，凝胶粒子直径2 mm时固定化效果最佳。对最优的酶促反应条件进行考察发现，反应的底物溶液中的DL-ATC浓度为0.8％、反应温度40℃、pH值为8.0时，可以得到最大的底物转化率。
　　 通过比较，固定化原生质体与固定化细胞具有同样的反复使用性能，均可以反复使用3次以上。经过20天4℃的低温冷藏，然后加入新鲜的产酶培养基进行酶活力复苏培养，原生质体在培养24 h左右可恢复酶活力90％以上。研究发现，蔗糖高渗液是比较合适的固定化原生质体贮藏液。结果还发现固定化原生质体比固定化完整细胞在前3次使用时的转化率都高15％左右。
　　 设计了柱式流化床反应器连续转化生成L-半胱氨酸技术路线。在最佳条件下制备原生质体固定化粒子，装柱后配制底物溶液进行最适条件下的连续转化反应，转化16 h后收集到含有产物浓度为5.04 mg/mL的溶液4900 mL，摩尔转化率为75.7％。使用Dowex50W×2 H+型阳离子交换树脂对产物进行了纯化，得到L-半胱氨酸产物结晶19.6 g，纯化收率79.4％。结晶后的产物经比旋光度、DTNB对巯基的特异性反应、Rf值以及高效液相色谱进行检测后定性为L-半胱氨酸。
　　 对L-半胱氨酸的高效液相色谱检测法进行方法学探讨。采用衍生试剂异硫氰酸苯酯(PITC)对L-半胱氨酸进行柱前衍生，衍生产物经高效液相色谱(HPLC)柱分离后用二极管阵列(PDA)检测器检测，对L-半胱氨酸实现了定性和定量测定。同时，采用PITC对DL-ATC酶法转化合成L-半胱氨酸的酶促反应液进行衍生，完成了酶促反应液中L-半胱氨酸的准确定量。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章绪论

1.1 L-半胱氨酸的理化性质

1.2 L-半胱氨酸的应用

1.3 L-半胱氨酸的生产方法

1.4固定化技术在L-半胱氨酸转化中的应用

1.5论文立题背景及主要内容

第二章转化底物产L-半胱氨酸菌株的筛选及其原生质体诱变

2.1引言

2.2实验材料

2.3实验方法

2.4实验结果及分析

2.5讨论

第三章原生质体的固定化及其转化制备L-半胱氨酸的研究

3.1引言

3.2实验材料

3.3实验方法

3.4实验结果及分析

3.5讨论

第四章 L-半胱氨酸的分析鉴定

4.1引言

4.2实验材料与仪器

4.3实验方法

4.4结果及分析

4.5讨论

参考文献

附录

致谢