甲壳类WAP结构域蛋白及Bax抑制因子1样蛋白的表达与功能研究

摘要

作为重要的甲壳类动物,中国明对虾和克氏原螯虾是研究无脊椎动物先天免疫系统良好的实验材料。通过对先天免疫系统相关基因的研究,有助于进一步弄清楚甲壳类抗菌以及抗病毒的免疫机理,为虾类病害的预防以及控制提供理论依据和技术支持；同时,也有助于无脊椎动物先天免疫理论的进一步完善。本研究选择了中国明对虾具有双WAP结构域蛋白基因、克氏原螯虾具有单个WAP结构域蛋白基因以及克氏原螯虾Bax抑制因子1样蛋白基因进行研究,得到了如下结果。
　　 1.中国明对虾DWD基因的表达和功能研究
　　 我们扩增到了中国明对虾具有双WAP结构域蛋白的cDNA序列,序列全长为787 bp,开放阅读框长度为354 bp,编码117个氨基酸。成熟肽具有101个氨基酸残基,预测的分子量为12.78 kDa,理论等电点为8.49。氨基酸一级结构的C端存在两个WAP结构域,每个结构域中存在保守的8个半胱氨酸残基。在转录水平上,Fc-DWD在血细胞、心脏、肝胰腺、鳃、胃、肠中都有分布；而且在病毒和细菌刺激后,基因在血细胞、肝胰腺、鳃、肠中的表达水平明显上调。同时,利用大肠杆菌表达系统进行了重组表达；制备多克隆抗体之后,进行细菌结合实验,发现rFc-DWD与实验所选择的革兰氏阳性以及阴性菌之间存在着较强的结合作用。并发现rFc-DWD能够抑制枯草芽孢杆菌和绿脓杆菌分泌的蛋白酶的活性。所以,根据表达模式的变化以及两种体外功能的研究结果,可以推测Fc-DWD在中国明对虾的先天免疫系统中具有重要作用,可能在抗菌以及抗病毒反应中发挥着免疫效应分子的功能。
　　 2.克氏原螯虾SWD基因的表达和功能研究
　　 我们扩增到了克氏原螯虾具有单WAP结构域蛋白的cDNA序列,序列全长为998 bp。开放阅读框为215 bp,编码74个氨基酸残基:一级结构的N末端的20个氨基酸残基为信号肽序列,C末端存在一个WAP结构域,结构域中含有8个保守的半胱氨酸残基。Pc-SWD的成熟肽含有54个氨基酸残基,预测其分子量为5.97kDa,理论上的等电点为7.71。在转录水平上,Pc-SWD在心脏和肠中的表达水平较高,在血细胞、肝胰腺和鳃中的表达水平较低,在胃中没有检测到该基因的表达。在翻译水平上,Pc-SWD主要在心脏、肝胰腺、鳃、和肠中高表达,在血细胞中的表达水平较低,同时,分泌到血淋巴中的Pc-SWD的量较少。在mRANA水平利用RT-PCR的方法研究了白斑病毒刺激后的该基因的表达模式,发现病毒刺激后在血细胞、肝胰腺、鳃、肠中,Pc-SWD的表达水平都发生明显上调。在蛋白质水平利用Western Blot技术,研究了Pc-SWD的表达模式,发现WSSV刺激后Pc-SWD在血淋巴中的分泌量逐渐增加,呈上调趋势；在血细胞中,Pc-SWD的表达量呈现出了上调趋势；而在心脏、鳃和肠中,Pc-SWD的表达量没有明显变化。通过细菌结合实验和抑制分泌型蛋白酶活性实验,发现利用大肠杆菌表达系统在体外重组表达的rPc-SWD,具有结合细菌的活性以及抑制分泌型蛋白酶的活性:因此,推测Pc-SWD是克氏原螯虾的一个免疫相关基因,可能在抗病毒免疫反应中发挥着重要功能。
　　 3.克氏原螯虾Bax抑制因子1样蛋白(BI-1)的基因克隆与表达模式研究
　　 我们扩增到了克氏原螯虾BI-1基因的cDNA序列,序列全长为1970 bp,开放阅读框为708 bp,编码235个氨基酸残基；在氨基酸一级结构中,N末端不具有信号肽序列,只包含一个由211个氨基酸残基构成的结构域。成熟肽预测的分子量为25.9 kDa,理论等电点为9.37。从qRT-PCR的结果来看,在转录水平上,Pc-BI-1主要分布在血细胞、心脏、肝胰腺、鳃、胃和肠中,而且在血细胞和心脏的表达水平较高；在肝胰腺、鳃、胃和肠中的表达水平较低。分别利用病毒和细菌刺激克氏原螯虾后,研究基因表达模式的变化情况,发现Pc-BI-1在血细胞、肝胰腺、鳃、肠中的表达水平明显上调。根据这些表达模式的变化情况,推测Pc-BI-1是一个免疫相关基因,可能在克氏原螯虾的先天免疫反应中发挥着重要作用,可能与抗菌以及抗病毒反应相关。

目录

文摘

英文文摘

符号说明

第一部分 综述:无脊椎动物的先天免疫系统

引言

第一章 无脊椎动物的先天免疫

一、物理防御

二、细胞免疫

三、体液免疫

第二章 中国明对虾先天免疫的研究进展

一、中国明对虾的养殖现状

二、中国明对虾的主要病原微生物

三、中国明对虾免疫系统的研究进展

第三章 免疫相关WAP结构域蛋白质的研究进展

一、WAP结构域蛋白质的结构特征

二、甲壳类动物WAP结构域蛋白质的分类

三、WAP结构域蛋白质的主要功能

第二部分 甲壳类WAP结构域蛋白的cDNA克隆、表达与功能研究

第一章 中国明对虾DWD基因的表达和功能研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第二章 克氏原螯虾SWD基因的表达和功能研究

一、前言

二、材料和方法

三、结果

四、讨论

第三部分 克氏原螯虾Bax抑制因子l样蛋白的cDNA克隆与表达模式研究

一、前言

二、材料和方法

1.材料

2.方法

三、结果

四、讨论

总结

参考文献

致谢

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