KGF对口腔黏膜上皮细胞凋亡及增殖的影响

摘要

目的:
　　 多种口腔黏膜病的发病与细胞凋亡密切相关;近来研究发现角质细胞生长因子（Keratinocytegrowthfactorreceptor，KGF）不仅能特异性的促上皮细胞增殖和分化，还抑制上皮细胞的凋亡。在课题组前期对KGF的研究发现在口腔扁平苔藓中KGF、KGFR及KGFmRNA的表达均较正常黏膜低，而KGF蛋白及KGFmRNA在口腔白斑中表达较正常黏膜高，推测KGF与口腔黏膜上皮细胞的增殖和凋亡有密切的联系。
　　 本实验通过观察不同浓度KGF对体外培养的口腔黏膜上皮细胞形态学影响，采用流式细胞仪技术检测上皮细胞凋亡率的改变，并应用荧光实时定量技术检测KGF对上皮细胞凋亡及增殖相关基因表达的影响，探讨KGF对口腔黏膜上皮细胞增殖及凋亡的作用，为进一步探讨研究KGF在口腔黏膜病发生发展中的作用提供依据，为口腔黏膜病的临床治疗提供一定的理论基础。
　　 方法:
　　 1.体外培养人口腔黏膜上皮细胞，取5～10代培养至70～80％融合时分别加入含不同浓度KGF(0ng/ml，5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml)的D-KFSM，将其分为对照组(KGF0ng/ml)和实验组(KGF5ng/ml，25ng/ml，50ng/ml)，共四组，培养12h、24h、48h后观察人口腔黏膜上皮细胞形态的改变;
　　 2.培养48h后流式细胞仪检测各组上皮细胞的凋亡率;
　　 3.分别培养12h、24h、48h后用荧光实时定量检测各组细胞内凋亡相关基因Bcl-2、BaxmRNA的表达;
　　 4.分别培养12h、24h、48h后用荧光实时定量检测各组细胞内增殖相关基因PCNAmRNA的表达;
　　 5.应用统计学方法对细胞凋亡率、Bcl-2、Bax、PCNAmRNA的表达数进行分析，得出结论。
　　 结果:
　　 1.观察细胞形态:相同时间段实验组较对照组上皮细胞贴壁紧，遮光性明显增强，培养48h后，实验3组（KGF50ng/ml）较其他组细胞核仁明显;
　　 2.流式细胞仪检测细胞凋亡率:不同浓度KGF培养48h后，随KGF浓度增加细胞的凋亡率减低(P＜0.05);
　　 3.荧光实时定量检测对凋亡的影响结果显示:
　　 (1)12h时实验1、2组较对照组上皮细胞内Bcl-2mRNA表达无显著差异，实验3组较对照组Bcl-2mRNA表达逐渐增加，有统计学意义（P＜0.05）;
　　 (2)24h时，各实验组较对照组Bcl-2mRNA表达均显著增加（P＜0.05），但各实验组间无统计学差异，(P＞0.05);
　　 (3)48h时各实验组较对照组Bcl-2mRNA表达均显著增加且呈剂量依赖性，(P＜0.05);
　　 (4)12h时，实验1、2组较对照组BaxmRNA表达无明显差异，(P＞0.05);实验3组较对照组BaxmRNA表达明显降低(P＜0.05);24h和48h时，实验组较对照组BaxmRNA表达逐渐降低，(P＜0.05);
　　 4.荧光实时定量检测对增殖的影响结果显示:各时间段实验组较对照组比PCNAmRNA表达均增加
　　 (1)12h时，各实验组间PCNAmRNA表达逐渐降低，(P＜0.05);
　　 (2)24h时实验组较对照组PCNAmRNA表达增加，(P＜0.05)，但各实验组间无统计学差异，(P＞0.05);
　　 (3)48h时，实验组较对照组PCNAmRNA表达增加，且呈剂量依赖性，(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 本研究发现外源性KGF能使体外培养的口腔黏膜上皮细胞凋亡率减低;外源性KGF可上调细胞凋亡相关基因Bcl-2mRNA的表达，下调BaxmRNA表达，并同时上调细胞增殖相关基因PCNAmRNA的表达，提示KGF通过调节细胞凋亡相关基因Bcl-2、BaxmRNA的表达抑制上皮细胞的凋亡，还能通过上调细胞增殖相关基因PCNAmRNA的表达促进上皮细胞的增殖，对上皮细胞有促进增殖和抑制凋亡的双重作用;为进一步探讨研究KGF在口腔黏膜病发生发展中的作用和治疗提供依据。