EZH2在卵巢癌细胞系A2780及LSL K-rasG12D/p53fl/fl转基因小鼠肿瘤形成中的作用研究

摘要

卵巢癌(ovarian cancer，OC)是妇科肿瘤中致死率最高的肿瘤，严重威胁妇女的健康和生命。表观遗传学在卵巢癌研究中的进展越来越引起重视。EZH2是一种甲基化酶，属于PRC复合物中重要的催化亚基，能够使组蛋白27位赖氨酸发生3甲基化，从而发挥表观遗传学的作用。组蛋白H3的27位赖氨酸(H3K27)的3甲基化能够诱导转录抑制，并参与所调控基因的表达。文献报道，EZH2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等多种肿瘤组织中表达异常增高。DZNep是EZH2的抑制剂，因其对肿瘤潜在的治疗作用备受关注。转基因小鼠是研究肿瘤发生发展的良好模型。基因敲除技术为在小鼠体内研究某一特定基因的功能提供了可行性。
　　 第一部分:EZH2对卵巢癌细胞系A2780增殖、集落形成能力的影响及机制研究
　　 研究背景:目前，对卵巢癌生物学特性、临床治疗方案以及医疗技术等方面的研究都获得了较大进展，但卵巢癌的病发率和病死率依然居高不下。EZH2是一种甲基化酶，属于PRC复合物中重要的催化亚基。它使组蛋白H3的27位赖氨酸发生3甲基化，从而发挥表观遗传学的作用。多种文献报道，EZH2在多种肿瘤组织中有高表达，例如乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠癌等。EZH2可能参与到肿瘤的增殖、凋亡、迁移、侵袭、转移等过程。据此，EZH2可能会与卵巢癌细胞A2780的增殖，集落形成等功能有关。
　　 目的:通过shRNA技术下调A2780细胞系EZH2的表达，研究EZH2对A2780细胞系增殖、克隆形成能力的影响，探索EZH2在卵巢癌发生过程中的作用。
　　 方法:慢病毒感染方法构建稳定下调EZH2的A2780细胞系;MTT检测稳定下调EZH2的A2780细胞系A2780-shEZH2增殖情况;集落形成实验检测A2780-shEZH2的克隆形成能力;实时定量荧光PCR检测A2780-shEZH2细胞系中，EZH2、相关抑癌症基因CDKN2A、DAB2IP的表达情况。
　　 结果:(1) A2780-shEZH2稳定细胞系的构建及鉴定:构建稳定A2780-shEZH2细胞系A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2，并有效沉默EZH2的表达。(2) MTT检测A2780-shEZH2稳转细胞的增殖:MTT检测显示A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2在24小时、48小时、72小时的抑制率分别是72.9±4.13％和64.9±3.26％、49.9±3.37％和49±4.05％、56.1±2.18％和57.9±2.17％。与对照组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。(3)克隆形成能力的研究:A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2两组卵巢癌细胞的克隆形成能力明显下降(P＜0.05）。转染对照组、A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2的克隆形成率分别是为9.8±0.07％，2.0±0.02％和1.9±0.03％。(4)实时定量荧光PCR检测:A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2中EZH2、CDKN2A、DAB2IP mRNA分别是对照组的62.8±8.12％和65.3±5.31％，230±4.31％和237±4.42％，269±7.62％和297±6.52％。A2780shEZH2-1和A2780shEZH2-2中CDKN2A和DAB2IP的mRNA明显上调，差异具有统计学意义(P＜0.05）。
　　 结论:(1)构建稳定下调EZH2的A2780-shEZH2细胞系，可作为良好的实验模型，深入研究EZH2表达调控与卵巢癌生物学功能的关系。(2)长效转染慢病毒颗粒pLKO.1-shEZH2能够高效、特异的沉默卵巢癌细胞系A2780中EZH2的基因表达。(3)长效转染慢病毒颗粒pLKO.1-shEZH2可以显著抑制卵巢癌细胞系A2780的增殖、克隆形成。(4)长效转染慢病毒颗粒pLKO.1-shEZH2可以显著抑制卵巢癌细胞系A2780中抑癌基因CDKN2A和DAB2IP的表达，促进卵巢癌的发生。

目录

声明

摘要

符号说明

第一部分 EZH2在卵巢癌细胞系A2780中增殖和集落形成能力的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第二部分 DZNep对卵巢癌A2780增殖、凋亡、迁移的影响和作用机制的研究

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

第三部分：EZH2对LSL K-rasG12D／p53fl／fl转基因小鼠肿瘤形成影响的研究

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

附图表

参考文献

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