纤维素酶活性架构及TrCel12A关键亚位点氨基酸功能研究

摘要

植物生物质能发酵成生物燃料及其他生物制品是潜在的可持续能源。生物质有效转化利用对缓解能源危机、防止环境污染具有重要的现实意义。可发酵糖单元的高效释放是生物质转化为生物燃料的瓶颈。植物生物质的高效降解依赖于糖苷水解酶系统协同作用。其中纤维素是植物细胞壁的重要组分，是自然界最丰富的多糖。纤维素酶在降解纤维素过程中发挥关键作用。纤维素酶根据不同的序列相似性归为不同的糖苷水解酶家族，且纤维素酶在不同家族及同一家族内部表现出功能混杂性，利用结构生物信息学的方法对不同纤维素酶家族及家族内部混杂性酶序列、结构、关键氨基酸分析将有助于我们了解纤维素酶识别底物的结构基础和共性规律，可以为纤维素酶的工程改造奠定理论基础。本文利用结构生物信息学的方法分析了纤维素酶家族活性架构及混杂性结构基础，并对GH12家族混杂性酶TrCel12A活性架构关键亚位点氨基酸进行定点突变及功能分析，以进一步阐明酶识别底物过程中的分子机制。本文主要内容及研究结果如下:
　　(1)分析不同纤维素酶家族活性架构混杂性结构基础
　　糖苷水解酶家族30％序列分类，使得每个纤维素酶家族具有相似的结构特征。家族内酶分子功能执行区域仅是催化结构域中非常小的一部分，分析活性架构区域序列及结构特性对研究混杂性具有重要意义。本文研究发现，活性架构区域氨基酸W、Y、N、D、E氨基酸出现频率较高;构建活性中心序列谱，每个纤维素酶家族具有不同的底物结合亚位点，保守氨基酸主要分布在-2到+1亚位点;各家族纤维素酶分子保守氨基酸识别底物糖环的氧原子模式各不相同，从而使其可对结构相近（molecular mimicry）的底物进行部分识别，这可能是各纤维素酶家族产生非专一性的结构基础。
　　(2)TrCel12A酶分子活性架构关键氨基酸突变及其混杂性分析
　　GH12家族TrCel12A酶分子在功能上具有混杂性，既具有纤维素酶活性，又具有木葡聚糖酶活性，同时对不同聚合度的可溶性底物也具有降解作用。有文献报道，混杂性与酶分子与底物的部分识别密切相关。本文对位于TrCel12A酶分子活性架构部位-2和-4底物结合亚位点色氨酸进行突变。突变结果显示，将色氨酸突变为酪氨酸由于增加了一个氢键从而增大了纤维素酶分子与底物CMC结合力，-4位点W7Y突变内切纤维素酶活性提高到144％，而-2亚位点W22Y突变虽提高了纤维素酶分子与CMC以及其中间产物的结合力，催化动力学常数Kcat下降明显，即产物释放受到抑制，导致酶活力下降，因此酶活力是产物结合与释放的平衡过程。根据酶分子不同位置亚位点对产物及其降解中间产物的混杂性不同影响对酶分子进行理性设计，为纤维素酶的理性设计提供了新思路。
　　(3)TrCel12A酶分子活性架构决定多底物特异性关键氨基酸功能研究
　　通过序列与结构比对发现，TrCel12A与HsCel12A酶分子序列相似度非常高(94％)，只有14个氨基酸差异，但两种酶分子却出现了功能分歧。TrCel12A既具有木葡聚糖活力又具有纤维素酶活力，而HsCel12A酶仅具有纤维素酶活力，因此这14个氨基酸的差异可能导致TrCel12A多底物特异性。本文对位于活性架构的T16、S63、A66位点进行突变，结果显示T16I、S63V、A66N突变体木葡聚糖酶活力具有一定程度的下降，表明通过进一步的序列分类对寻找决定底物特异性氨基酸具有一定的指导意义。
　　(4)TrCel12A酶分子活性架构关键氨基酸与底物相互作用机理分析
　　N20位于TrCel12A酶分子活性架构-2亚位点位置，是其活性架构中心部位保守氨基酸，与底物-2位糖环C2位置的羟基形成氢键，对结合纤维素底物起着关键作用，对其进行突变显示N20D其酶解产物谱未变化，但酶活力降低48％，测定其催化动力学常数发现，Km升高，Kcat也升高，但Kcat/Km下降;通过ITC测定其与CMC底物的结合力发现，N20D较野生型与底物结合力变弱，通过N20位点氨基酸突变，可以表明天冬酰胺和天冬氨酸在-2亚位点与底物结合的贡献程度。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 绪论

1．1 植物生物质抗降解屏障

1．1．1 植物细胞壁的组织结构层次

1．1．2 木质纤维素的组分

1．1．3 纤维素的组成结构

1．2 主要高效降解纤维素酶系统

1．2．1 高效降解纤维素的微生物来源

1．2．2 “非复合体”纤维素酶系

1．2．3 “复合体型”纤维素酶系

1．2．4 “非复合体细胞结合型”纤维素酶系

1．3 纤维素酶相关生物信息学研究进展

1．3．1 糖苷水解酶序列分类法

1．3．2 纤维素酶自动功能注释与混杂性

1．4 酶混杂性(promiscuity)研究

1．4．1 混杂性分类层次

1．4．2 引起酶混杂性的条件

1．4．3 引起酶混杂性机制

1．4．4 混杂性与蛋白质工程

1．5 立题依据

第二章 纤维素酶活性架构生物信息学分析

2．1 材料与方法

2．1．1 生物信息学分析软件与网站

2．1．2 数据获取及筛选

2．1．3 序列比对与结构比对

2．1．4 氨基酸频率统计

2．1．4 纤维素酶家族活性架构与活性中心序列谱

2．1．5 活性中心序列谱稳定性检验

2．2 结果与分析

2．2．1 纤维素酶多功能性的表现形式

2．2．2 纤维素酶混杂性可能机制

2．2．3 纤维素酶混杂性的共同结构基础

2．3 小结与讨论

第三章 TrCel12A酶分子活性架构关键氨基酸突变及其功能研究

3．1 材料与方法

3．1．1 菌株与质粒

3．1．2 主要的仪器及试剂

3．1．3 主要的培养基

3．1．4 主要引物

3．1．5 突变质粒构建与扩增

3．1．6 毕赤酵母GS115异源表达突变蛋白及纯化

3．1．7 突变蛋白催化动力学常数Kcat、Km测定

3．1．8 等温量热滴定(ITC)测定突变蛋白热力学常数

3．1．9 荧光辅助糖电泳(FACE)分析突变蛋白酶解产物谱变化

3．2 结果与讨论

3．2．1 eg3基因关键位点W7位点的选择

3．2．2 eg3基因关键位点氨基酸突变、质粒构建及检测

3．2．3 活性架构W7位点突变蛋白表达与纯化

3．2．4 活性架构W7位点突变蛋白CMC酶活力测定

3．2．5 活性架构W7、W22位点突变蛋白Kcat、Km测定

3．2．6 活性架构W7、W22位点突变对酶分子与CMC结合能力影响

3．2．7 活性架构W7位点对降解RAC底物的影响

3．2．8 结构生物信息学分析活性架构W7、W22位点突变对TrCel12A酶分子功能的影响

3．3 小结

第四章 TrCel12A酶分子活性架构决定多底物特异性关键氨基酸功能研究

4．1 材料与方法

4．1．1 菌株与质粒

4．1．2 主要仪器及培养基

4．1．3 主要引物

4．1．4 重组质粒构建与扩增

4．1．5 毕赤酵母GS115异源表达突变蛋白及纯化

4．1．6 突变蛋白性质检测

4．1．7 荧光辅助糖电泳(FACE)分析突变蛋白酶解产物谱变化

4．2 结果与分析

4．2．1 突变关键氨基酸位点序列与结构分析

4．2．2 基因egl3关键氨基酸的定点突变

4．2．3 突变体蛋白的表达纯化

4．2．4 突变蛋白酶活性质测定

4．2．5 突变体蛋白对降解RAC底物的影响

4．3 小结与讨论

第五章 TrCel12A酶分子活性架构关键氨基酸与底物相互作用机理分析

5．1 材料与方法

5．1．1 菌株与与质粒

5．1．2 主要仪器及试剂

5．1．3 主要培养基

5．1．4 重组质粒构建与扩增

5．1．5 毕赤酵母GH115异源表达突变蛋白及纯化

5．1．6 突变蛋白酶活性质检测

5．1．7 突变蛋白催化动力学常数Kcat、Km测定

5．1．8 等温量热滴定(ITC)测定突变蛋白热力学常数

5．1．9 突变关键氨基酸位点结构分析

5．2 结果与分析

5．2．1 活性架构N20位点蛋白表达与纯化

5．2．2 N20突变对酶分子与底物相互作用的影响

5．3 小结与讨论

全文总结与展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的学术论文