冷刺激诱导的内脏脂肪棕色变对小鼠代谢的影响及机制研究

摘要

本文分为以下两个部分进行探讨：
　　论文Ⅰ 冷刺激对正常和肥胖小鼠内脏脂肪的影响
　　目的：
　　1.研究冷刺激对正常小鼠VAT以及SAT、BAT的影响;
　　2.研究冷刺激对DIO小鼠VAT以及SAT、BAT的影响。
　　方法：
　　1.实验动物:
　　所有动物实验均遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会的规定及要求。7-8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠，购自北京华阜康生物科技股份有限公司，引自美国Jackson Laboratory。
　　2.动物实验分组
　　第一部分 冷刺激模型的构建（梯度降温）:C57BL/6小鼠随机分四组，30℃对照组和4℃、-10℃和-10℃/-20℃三个冷刺激组。冷刺激组置于18℃适应一周后进入4℃中一周。此后4℃组保持在4℃至4周后实验结束。-10℃和-10℃/-20℃组经白天-5℃、夜晚4℃适应三天后，再经白天-10℃夜晚4℃适应四天。此后-10℃组保持在-10℃中至3周后实验结束。-10℃/-20℃组则保持白天-20℃夜晚-10℃中至实验结束。-10℃和-10℃/-20℃组的饮水频繁更换，并在饲养笼中加入雪霜维持湿润。30℃小鼠直接置于30℃中，时间与冷刺激组保持一致。
　　第二部分 C57BL/6给予含60％脂肪的高脂饮食4个月后随机分为30℃，4℃，-10℃和-10℃/-20℃四个组，冷刺激方法同第一部分。
　　3.小鼠核心体温和血压的检测:
　　上午10-12时测量小鼠直肠温度为核心体温;使用小动物血压计通过尾动脉袖套方法测量小鼠血压。
　　4.小鼠脂肪的microPET扫描:
　　小鼠饥饿约3小时后异氟烷吸入麻醉，尾静脉注射200～300μCi18F-FDG。一小时后，将小鼠不同部位的脂肪组织快速解剖下来行microPET扫描。
　　结果：
　　1.冷刺激对正常小鼠饮食量、体重(BW)、体重指数(BMI)、各部位脂肪重量、各脏器重量、核心体温和血压的影响
　　冷刺激增加小鼠饮食量，各冷刺激组间无显著差异。体重、体重指数、各部位脂肪重量减少。BW、BMI和eWAT、subcWAT重量随温度降低逐渐减少。各冷刺激组心脏增大;肝、脾和肾脏4℃时增大，温度降低而减轻;肺脏无明显变化。各组核心体温和血压无显著差异。
　　2.冷刺激对正常小鼠VAT、SAT和BAT的影响
　　内脏脂肪eWAT、腹膜后脂肪(rWAT)和肠系膜脂肪(mWAT)的HE和脂滴包膜蛋白PerilipinA染色显示冷刺激下脂肪细胞逐渐变小，并出现多房样脂滴结构;棕色化指标UCP1的免疫组化染色阳性证实发生了棕色变。冷刺激程度越大，UCP1的阳性染色越多，线粒体标记物Prohibitin和血管内皮Endomucin、CD31的染色也逐渐增多。冷刺激可以增加subcWAT和iBAT的UCP1、Prohibitin和Endomucin染色，subcWAT的棕色化程度随温度的降低升高，而各冷刺激组间iBAT分析无统计学差异。qPCR和WB检测UCP1的表达显示冷刺激可以上调各部位脂肪UCP1的mRNA和蛋白水平。MicroPET扫描显示随着温度的降低eWAT和subcWAT对18F-FDG的摄取增加，iBAT对18F-FDG的摄取在30℃时最低，冷刺激时明显增加。
　　3.基因芯片及冷刺激对正常小鼠各部位脂肪产热基因、脂肪因子和棕色化相关转录因子mRNA水平的影响
　　基因芯片结果显示冷刺激可引起正常小鼠eWAT中一系列与代谢相关的通路改变，促进脂降解的相关基因表达上调。qPCR结果显示冷刺激可上调正常小鼠eWAT和subcWAT中与棕色化及脂降解相关的产热基因Dio2、Cidea和Cox7a1的表达，下调脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin的表达，对Resistin影响不大，棕色化相关转录因子Pgc1α变化不明显，Prdm16和Ebf2表达降低或不变。除轻度上调Dio2外冷刺激显著下调iBAT中Cidea、Cox7a1、Leptin、Adiponectin、Irisin、Resistin、Pgc1α、Prdm16和Ebf2表达，提示冷刺激对不同部位脂肪的作用不同。
　　结论：
　　1.冷刺激可减少正常及DIO小鼠各部位脂肪蓄积，并且此作用不依赖于进食量;
　　2.冷刺激可诱导正常小鼠VAT发生棕色变，同时激活BAT和皮下脂肪，VAT对冷刺激诱导棕色变的敏感性低于SAT;
　　3.冷刺激可诱导DIO小鼠VAT发生棕色变，同时激活BAT和皮下脂肪，与正常小鼠相比DIO小鼠SAT对冷刺激的敏感性较低;
　　4.冷刺激可改变VAT的表达谱，促进脂降解相关基因表达，加速脂降解;
　　论文Ⅱ 内脏脂肪棕色化对代谢的影响及机制研究
　　目的：
　　1.研究不同程度冷刺激对小鼠代谢的影响;
　　2.研究内脏脂肪棕色变改善小鼠代谢的相关机制。
　　方法：
　　1.实验动物:
　　7-8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠购自北京北京华阜康生物科技股份有限公司，引自美国Jackson Laboratory。129S-Ucp1 tm1Kz/J小鼠，购自美国JacksonLaboratory。所有动物实验均遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的规定及要求。
　　2.动物实验分组
　　第一部分 正常小鼠冷刺激模型的构建:同论文Ⅰ。
　　第二部分 饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠冷刺激模型的构建:同论文Ⅰ。
　　第三部分 附睾脂肪去除和移植实验:手术去除eWAT后行冷刺激，冷刺激方法同论文Ⅰ。脂肪移植实验30℃的小鼠随机分为两组，分别接受等量来自-10℃/-20℃或30℃小鼠的eWAT。
　　第四部分 UCP1-/-小鼠实验:对UCP1-/-小鼠实施冷刺激。
　　第五部分 β3肾上腺素能受体激动实验:室温下C57BL/6小鼠随机分两组，一组接受β3肾上腺素能受体激动剂CL316243腹腔注射，另一组接受等量的生理盐水作为对照。
　　3.小鼠血糖、糖耐量和胰岛素耐量的检测
　　使用罗氏血糖仪和试纸检测血糖。糖耐量实验小鼠过夜饥饿12h，胰岛素耐量实验小鼠饥饿6h，冷刺激组置于18℃、30℃组置于30℃饥饿。给予小鼠腹腔注射2g/kg体重葡萄糖或0.5U/kg（正常小鼠）或0.75U/kg（肥胖小鼠）体重胰岛素之前和15、30、60、90和120分钟后采尾端血测定血糖。
　　4.小鼠代谢率的检测:
　　麻醉好的小鼠放置于33℃的小动物呼吸代谢检测仪中测量30分钟基础状态下的氧耗量和二氧化碳呼出量，皮下注射1mg/kg体重去加肾上腺素后继续检测90分钟代表非战栗性产热(NST)能力。
　　结果：
　　1.冷刺激对正常小鼠代谢的影响
　　NST检测冷刺激可显著增加小鼠的氧耗量和二氧化碳呼出量，-10℃和-10℃/-20℃的氧耗量和二氧化碳呼出量高于4℃，冷刺激显著增强小鼠代谢，提高适应性产热能力。冷刺激可以显著降低血TG、NEFA和LDL-C的水平，TG的降低呈现温度依赖性，温度越低下降越明显。冷刺激有降低TC、HDL-C的趋势，-10℃/-20℃组TC、HDL-C水平低于其他各组。空腹血糖各组间无统计学差异，-10℃/-20℃组的空腹胰岛素水平显著降低，GTT和ITT实验显示-10℃和-10℃/-20℃组血糖水平和曲线下面积低于30℃和4℃，说明内脏脂肪棕色化可以改善小鼠糖耐量和胰岛素耐量。
　　2.冷刺激对DIO小鼠代谢的影响
　　与30℃相比，冷刺激可增加DIO小鼠的代谢，-10℃和-10℃/-20℃组的NST能力高于4℃。冷刺激显著降低血TG、TC和LDL-C的水平，-10℃和-10℃/-20℃组TG水平低于4℃组。冷刺激可以明显降低DIO小鼠的空腹血糖和空腹胰岛素水平，-10℃和-10℃/-20℃组血糖和胰岛素水平低于4℃组。GTT和ITT实验显示各-10℃和-10℃/-20℃组血糖水平和曲线下面积低于30℃和4℃，证实冷刺激改善肥胖小鼠糖耐量和胰岛素耐量。冷刺激可以减轻DIO小鼠肝脏重量，减少肝内的脂质沉积。
　　3.内脏脂肪棕色化可激活Creatine驱动的替代产热途径，但UCP1主导的产热起主要作用
　　冷刺激可以增加eWAT中肌酸激酶(CK)的活性，棕色化程度越高，CK活性越高。冷刺激可增加eWAT中Creatine的含量，同时降低PCr的含量，-10℃/-20℃组Creatine含量最高，PCr含量最低，表明CK/Cr/PCr途径被激活。冷刺激可降低UCP1-/-小鼠核心体温，致使在零下低温环境中无法存活，表明替代产热途径无法取代UCP1介导的产热。
　　结论：
　　1.冷刺激可促进正常和DIO小鼠的代谢和NST能力，激活的内脏脂肪可影响小鼠的整体代谢。
　　2.冷刺激可降低正常和DIO小鼠血TG，改善糖耐量和胰岛素耐量，减少DIO小鼠肝脏的脂质沉积。
　　3.棕色化的内脏脂肪可同时利用UCP1和Creatine驱动的线粒体底物循环增加产热。
　　4.β3肾上腺素能受体激活可能是冷刺激诱导内脏脂肪棕色化并改善代谢的主要机制。

目录

声明

论文Ⅰ 冷刺激对正常和肥胖小鼠内脏脂肪的影响

摘要

符号说明Ⅰ

前言

材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附表

附图

参考文献

论文Ⅱ 内脏脂肪棕色化对代谢的影响及机制研究

摘要

符号说明Ⅱ

前言

材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

附表

附图

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表SCI文章

SCI论文Ⅰ

SCI论文Ⅱ