酿酒酵母循环利用二氧化碳高效合成生物乙醇的研究

摘要

全球气候变暖是人类社会面临的一大挑战，为解决化石燃料的过度依赖并缓解温室气体释放，可再生替代能源的研发亟待进行。利用微生物转化生物质合成液体燃料是减少温室气体排放和降低化石燃料依赖的一种有效策略。然而，传统发酵过程以谷物和甘蔗等农作物为原料，将引起“粮食与燃料”之间的矛盾;以木质纤维素为原料合成生物乙醇可以有效缓解CO2释放，但无法直接减少大气中CO2的含量;光合自养微生物虽然可以直接利用大气中的CO2，但其目标燃料或高附加值化工产品的产量尚无法达到产业化要求。因此，若将异养工程菌高效发酵木质纤维素合成生物燃料的特性与自养微生物直接利用CO2的优势进行结合，同步实现生物乙醇的高效合成与CO2的循环利用，将“碳中性”过程转变为CO2减量的生物过程，将更有效的调控和减少CO2的排放。
　　基于此，本研究在酿酒酵母Saccharomyc es cerevisiae工程菌中构建了以大肠杆菌Escherichia coli GroE为基础的外源基因表达平台，有效实现了原核蛋白在真核体系中的翻译后修饰，并在此基础上将卡尔文循环(Calvin Cycle)中磷酸核酮糖激酶(Phosphoribulokinase，PRK)和核酮糖-1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（Ribulose-1,5-Bisphosphate Carboxylase/Oxygenase,RuBisCO）引入S.cerevisiae,构建外源还原型戊糖代谢途径，循环利用部分乙醇发酵过程中释放的CO2，提高乙醇产量。本研究的主要内容和结论如下:
　　(1)研究通过共表达E.coli的HSP60分子伴侣体系GroE，首次实现了E.coli木糖异构酶、阿拉伯糖异构酶以及Agrobacterium tumefaciens阿洛酮糖差向异构酶在S.cerevisiae中的有效表达，证明HSP60分子伴侣体系在真核与原核细胞之间的差异是导致部分细菌蛋白无法在酵母中有效表达的原因。由于GroE体系基于分子间的疏水效应，且与HSP70和HSP90等分子伴侣体系的相互作用较少。因此，共表达E.coli GroE伴侣蛋白体系可以作为一种广适性的翻译后修饰工具，协助细菌外源蛋白在酵母中达到其功能构型，从而实现其有效表达。
　　(2)在E.coli GroE平台的基础上，在S.cerevisiae工程菌中成功表达了Rhodospirillum rubrum RuBisCO，并通过增加RuBisCO编码基因cbbM的拷贝数提高了其活性。结果表明，RuBisCO和PRK的共表达可以成功构建还原型戊糖代谢通路，实现发酵过程中CO2的循环利用，提高木糖发酵效率和乙醇产量。同时，还原型戊糖代谢通路的建立可以使CO2可以作为电子受体，缓解XR(Xylosereductase)/XDH(Xylulose dehydrogenase)代谢路径在发酵木糖时氧化还原反应的失衡，减少副产物甘油和木糖醇的产生。
　　(3)研究发现CO2对S.cerevisiae工程菌发酵合成乙醇具有明显影响。通过CO2吹扫增加初始CO2浓度可以有效提高乙醇产量并减少副产物的积累。该效应不受糖酵解及戊糖磷酸代谢通路等碳源代谢途径以及培养体系的影响。研究利用合成生物学手段，通过调控丙酮酸羧化酶(Pyruvate carboxylase，PYC)的表达强度发现，CO2作用机制受PYC的调控，且其可能作为全局调控因子实现对乙醇发酵的促进。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 全球气候变暖

1．1．1 全球气候变化及环境效应

1．1．2 温室气体排放

1．1．3 化石燃料依赖

1．2 生物燃料合成

1．2．1 第一代生物燃料

1．2．2 新型生物燃料

1．2．3 木质纤维素的资源化

1．2．4 一碳化合物(C1)利用

1．3 代谢工程与合成生物学

1．3．1 基因工程菌的构建

1．3．2 基于CRISPR的基因编辑技术

1．4 本研究的意义、目的及内容

1．4．1 本研究的意义和目的

1．4．2 本研究的主要内容

1．4．3 本研究的主要创新点

第二章 酿酒酵母中原核基因表达体系的构建

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 实验菌株与培养基

2．2．2 质粒构建

2．2．3 基于CRISPR／Cas的基因编辑技术

2．2．4 酶活性测定

2．2．5 生长情况及糖消耗测定

2．2．6 统计分析

2．3 结果与讨论

2．3．1 木糖异构酶与阿拉伯糖异构酶在酿酒酵母中的表达

2．3．2 木糖异构酶活性的验证

2．3．3 阿拉伯糖异构酶活性的体内验证

2．3．4 阿洛酮糖-差向异构酶(DPE)的表达

2．3．5 GroE体系对功能基因表达的影响

2．3．6 GroE体系的作用机制

2．4 本章小结

第三章 还原型戊糖代谢途径的构建

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验菌株和培养基

3．2．2 质粒构建

3．2．3 基于CRISPR／Cas的基因编辑

3．2．4 RuBisCO活性测定

3．2．5 厌氧发酵实验

3．2．6 CO2与乙醇比例分析

3．2．7 统计分析

3．3 结果与讨论

3．3．1 核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶在酵母工程菌中的表达

3．3．2 磷酸核酮糖激酶对木糖发酵的影响

3．3．3 还原型戊糖代谢途径的构建

3．3．4 循环利用发酵过程中CO2的机制解析

3．4 本章小结

第四章 二氧化碳对生物乙醇发酵的促进效应

4．1 引言

4．2 材料与方法

4．2．1 实验菌株与培养基

4．2．2 基于CRISPR／Cas的启动子调控

4．2．3 质粒构建

4．2．4 发酵实验

4．3 结果与讨论

4．3．1 初始CO2浓度对还原型戊糖代谢通路的影响

4．3．2 CO2及HCO3-酵母发酵促进作用的广适性

4．3．3 不同培养基条件下CO2及HCO3-对酵母发酵的影响

4．3．4 丙酮酸盐羧化酶对木糖发酵的影响

4．3．5 碳酸酐酶对发酵的调控

4．4 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．2 展望

参考文献

致谢

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附录

附录三 已发表论文全文