通过原生质体融合得到的乙醇抗性酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)GP-01,其生产方法,通过利用酿酒酵母GP-01和作为锗来源的高水溶性偏锗酸钠生产包含高含量生物有机锗的酵母的方法

摘要

本发明涉及一种通过使用乙醇抗性酵母和偏锗酸钠(Na2GeO3)，通过原生质体融合，生产包含高含量有机生物锗的酵母的方法。为了增强对抑制酵母生长的乙醇的抗性，本发明提供了用于生产突变的酿酒酵母(ye，d&tGP-01，KCTC 11399BP)的方法，该酵母GP-01具有乙醇抗性并通过将酿酒酵母(Saccharomyces cervisiae)(KCTC7904)和乙醇假丝酵母(Candidaethanolica)(KCTC7181)的原生质体融合得到。此外，本发明提供了包含高含量有机生物锗的酵母(酵母Ge-32K)和用于生产酵母Ge-32K的方法，该方法包括以下步骤：将酵母GP-01以1∶0.5-2的体积比加入到偏锗酸钠(Na

说明书

技术领域

本发明涉及具有乙醇抗性并包含高含量有机生物锗的酵母和用于生 产该酵母的方法。更具体地说，该方法包括：通过酿酒酵母(Saccharomy  ces cervisiae)(KCTC7904)和乙醇假丝酵母(Candida ethanolica)(KCT C7181)的原生质体融合生产突变的酿酒酵母(S.cervisiae)，即酵母GP-0 1，所述的酵母GP-01对高浓度乙醇具有抗性；将酵母GP-01与偏锗酸钠(N a₂GeO₃)进行培养，以便通过生物转化将锗接种到酵母GP-01中；和最终获 得具有乙醇抗性并包含高含量有机生物锗的突变的酵母(以下称酵母Ge- 32K)。

背景技术

锗分类为有机锗和无机锗(GeO₂)。已知在人类器官内累积较长时间的 无机锗导致强的毒性。

有机锗天然地包含在微生物、矿物质水和医用草药中。而且，可以通 过在真菌体内生物合成或者化学合成生产有机锗。有机锗与细胞中的蛋白 质、肽等结合，并且通过许多论文和科学期刊(Kor.J.Microbiol.Biotechnol.， 2007.35(2)：118-127；J.Kor.Soc.Food Sci.Nutr.2006.35(6)：683-689；J.Kor. Soc.Appl.Biol.Chem.2005.48(3)：246-251；Immune Network.2006. 6(2)：86-92)建立了有机锗用于增强免疫力、抑制肿瘤细胞的产生和扩散(转 移)、治疗和预防各种慢性疾病等的疗效。此外，众所周知有机锗具有以 下功能：通过向细胞提供氧的抗癌活性(J.Orthomol.Medicin.，1986. 1：145-148)；纯化血液(Medicin.Hy-phothesis.，1988.26：207-215)；通过活 化NK细胞和巨噬细胞增强免疫力(Microbiol.Immunol.，1985.29：65-74； Kor.J.Microbiol.Biotechnol.，2007.35(2)：118-127)；诱导干扰素生成 (Gantokagakutyoho，9：1976-1980)、抑制癌细胞产生和扩散(Cancer and  Chemotheraphy.1985.12(12)：2345-2351)；抑制关节炎(Autonomic& Autacoid Pharmacol.2005.25：129-134)；预防和治疗各种疾病，例如神经痛 (Biotechnol.Appl.Biochem.，1986.8：379-386)、骨质疏松症(Germanium；The  health and life enhancer.1988)；降低高的血压(高血压)和高脂血症胆固 醇(Pharmacol.，1990.41：286-291)；缓解肝毒素(J.Kor.Soc.Food.Nutr.， 1994.23(4)：581-586)等。由于所述的众所周知的疗效，在美国、日本、欧 洲和韩国，在几十年中，对有机锗已经广泛地进行了许多研究，所述的研 究试图将其用于治疗各种顽固性疾病，例如癌症和心脏病等(Anticancer  Res.，1985.5(5)：479-483)。

可以通过从药用草药，例如人参(ginseng)、灵芝(ganoderma)中提 取得到有机锗，但由于其高成本和低生产率此种方法很难商业化。此外， 可以通过利用有机酸化学合成二氧化锗(GeO₂)获得有机锗，但从化学合 成中得到的产品中包含无机锗，因此由于未确认的安全性，在食物或药物 供给中的用途受到限制(US FDA的进口警戒，1988)。

事实上，酵母在烘焙业、糖果业和酿酒业中大量地使用了数千年。而 且，酵母自身作为人类食物的来源是有用的，并且作为下一代蛋白质的来 源作为单细胞蛋白(SCP)是有吸引力的，，所述的单细胞蛋白理想地由蛋 白质、维生素、矿物质等组成，其特征在于高蛋白和低脂肪。

此外，在单细胞中，酵母是维生素B的最好来源，并包含许多酶类等， 这些酶主要服务于体内的代谢。在这方面，酵母用作保健产品。最近，对 保健产品进行了大量的研究和开发，从而通过得到的酵母实现生理和药用 效果。为了实现所述目的，非常需要开发包含高含量有机生物锗的酵母。

在传统方法中，通过在包含无机锗(GeO₂)的培养基中培养酵母来生 产包含有机生物锗的酵母。由于酵母在包含高含量无机锗的培养基条件下 生长受到限制这一缺点，因此在传统方法中难以有成本效益并且大规模地 生产包含适量有机生物锗的酵母。

为了弥补上述缺点，尝试了将生产球团(pellet)形式的酵母的过程和 将二氧化锗(GeO₂)接种到所得到的酵母中的过程独立地进行的方法。然 而，在以上方法中，由于在酵母培养过程中产生的乙醇和接种到酵母中的 二氧化锗(GeO₂)的含量极低，球团状(palletized)酵母的产率太低以致不 能商业化。

而且，已知的是在上述方法中使用的二氧化锗(GeO₂)在25℃下的 溶解度为5.2g/L，该溶解度对于酵母生长是抑制剂(J.Ind.Microbiol. Biotechnol.，1989.4(4)：299-306)。

因此，非常地需要发明出通过使用具有较高溶解度但毒性远低于二氧 化锗(GeO₂)的无机锗，来生产包含高含量有机锗的乙醇抗性酵母的方法。

发明公开内容

技术问题

本发明的目的是提供具有乙醇抗性的酵母GP-01(Saccharomyces  cervisiae GP-01，KCTCl 1399BP)以增加酵母产率，和用于生产酵母GP-01 的方法。

本发明的另一个目的是提供用于生产酵母Ge-32K的方法，所述的酵 母含有高含量有机生物锗，通过突变的酿酒酵母(乙醇抗性酵母GP-01) 和偏锗酸钠(Na₂GeO₃)的生物合成获得的。

本发明的再一个目的是提供用于生产通过突变的酿酒酵母(酵母 GP-01，KCTC-11399BP)的生物合成和偏锗酸钠(Na₂GeO₃)获得的、包含高 含量有机生物锗的酵母Ge-32K的方法。

技术方案

本发明涉及具有乙醇抗性并具有有机锗生产能力的突变的酿酒酵母 (酵母GP-01，KCTC 11399BP)和用于生产包含高含量有机生物锗的酵母 Ge-32K的方法，所述方法包括用偏锗酸钠(Na₂GeO₃)培养所述的酵母 GP-01。

有益效果

根据本发明，通过酿酒酵母(KCTC-7904)和乙醇假丝酵母(KCTC 7181)的原生质体融合可以生产多种的酵母GP-01。所得到的酵母GP-01 具有乙醇抗性，这使得能够在高乙醇条件下培养。本发明的乙醇抗性酵母 GP-01可以克服现有技术中由于在酵母培养过程中产生乙醇而导致酵母生 长产率降低的缺点。

此外，由于培养的酵母GP-01的生产率与最初酵母(KCTC-7904)的 生产率相比，增加了超过3倍，因此可以通过利用本发明的酵母GP-01实 现包含高含量有机生物锗的酵母Ge-32K的大规模生产。

在将锗接种到球团状酵母GP-01的过程中，本发明使用溶解度为 500g/L的偏锗酸钠(Na₂GeO₃)代替现有技术中通常使用的二氧化锗 (GeO₂)，由于锗的更高溶解度和离子可传送性，同时锗的毒性低于二氧 化锗从而增加了酵母中锗的生物转化速率。因此，获得包含的有机生物锗 的含量比使用二氧化锗(GeO₂)的现有技术的含量高2或3倍的酵母 Ge-32K对于本发明来说是可能的。

同时，在用偏锗酸钠(Na₂GeO₃)培养酵母GP-01(KCTC 11399BP)的过 程中，为了使有机生物锗更有效地通过生物转化接种到球团状酵母中，本 发明添加了表面活性剂。

附图简述

图1是显示根据pH的变化，本发明的酵母GP-01中生物锗含量的图 形。

图2是显示根据温度的改变，本发明的酵母GP-01中生物锗含量的图 形。

图3是显示根据表面活性剂按wt％计的浓度的变化，本发明的酵母 GP-01中生物锗含量的图形。

发明的方式

本发明涉及突变的酿酒酵母，即具有生产有机锗能力的酵母GP-01 (KCTC 11399BP)。

所述的突变的酿酒酵母，即酵母GP-01适当地保存在韩国生命科学与 生物技术研究院(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology) 的韩国典型菌种保藏中心(Korea Collection for Type Culture)，保藏编号为 KCTC 11399BP。

更具体地说，本发明提供了具有乙醇抗性的突变酿酒酵母GP-01(酵 母GP-01，KCTC 11399BP)，其中所述方法包括将酿酒酵母(KCTC7904) 与有效利用乙醇的乙醇假丝酵母(KCTC 7904)的原生质体融合。

此外，本发明提供了包含高含量有机生物锗的酵母Ge-32K，所述酵 母可以通过将酵母GP-01与偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液培养，从而通过生物转 化将锗接种到酵母中进行制备。

所述的突变酵母可以通过酿酒酵母(KCTC7904)和乙醇假丝酵母 (KCTC7181)的原生质体融合获得，所述的原生质体融合使用混合了1M 山梨醇作为渗透压稳定剂，0.5M的2-巯基乙醇作为还原剂的溶液。

而且，原生质体可以通过将球团状的酵母悬浮在添加细胞壁水解酶使 细胞壁分解的山梨醇溶液中获得。在这种情况下，1M山梨醇与2-巯基乙 醇优选的体积比为1∶2-4，更优选地为1∶2-3。

同时，所述的原生质体融合通过将酿酒酵母(KCTC7904)和乙醇假 丝酵母(KCTC7181)的两种原生质体加入到混合溶液中实现，该混合溶 液由分子量为4000的聚乙二醇、10mM氯化钙(CaCl₂)和选自1M山梨 醇、蔗糖和甘露醇的溶液之一组成。

在这种情况下，选择的一种溶液(1M山梨醇)、聚乙二醇和氯化钙 (CaCl₂)的优选体积比为1∶2-4∶2-5，更优选地为1∶2-3∶2-4。

本发明提供了用于生产包含高含量有机生物锗的酵母Ge-32K的方 法。该方法包括将酵母GP-01与偏锗酸钠(Na₂GeO₃)培养。

酵母GP-01(KCTC 11399BP)与偏锗酸钠(Na₂GeO₃)的优选体积比为 1∶0.5-2，更优选地为1∶1。

此外，为了通过生物转化将锗接种到酵母中，优选地在pH 9-10和 30-40℃温度下将酵母GP-01与偏锗酸钠(Na₂GeO₃)培养。以上培养步骤可 以通过培养酵母的普通方法实现。

通过本发明所述方法，可以获得包含相对高含量的有机生物锗的酵母 Ge-32K。

在下文中，提供了用于生产乙醇抗性酵母GP-01和用于生产包含高含 量有机生物锗的酵母Ge-32K的本发明的更加详细的方法。

第一个过程：生产乙醇抗性的原生质体融合酵母

通过融合和培养酿酒酵母(KCTC7904)和乙醇假丝酵母(KCTC7181) 的两种原生质体获得原生质体融合的酵母，其中酿酒酵母和乙醇假丝酵母 保藏在韩国生命科学与生物技术研究院的韩国典型菌种保藏中心 (KCTC)。

更详细地说，分别培养酿酒酵母(KCTC7904)和乙醇假丝酵母 (KCTC7181)。离心所得到的培养基以获得球团状的酵母。

优选的是，在对数生长早期当培养基的光密度值(O.D.)为0.45-0.50 时进行培养基的离心。可以从菌株的每个培养基或者两个菌株一起培养的 一个培养基中获得球团状酵母。

以1∶1的比例将两种球团状酵母加入到混合了1M山梨醇和0.5M 2- 巯基乙醇的溶液中以清洗酵母两次。将经清洗的酵母静置预定的时间，然 后将包含细胞壁水解酶的溶液以1∶1的比例加入到肉汤(包含球团状的酵 母、1M山梨醇和0.5M 2-巯基乙醇)中。使酵母悬浮在肉汤中以生成原生 质体。

将1M山梨醇、聚乙二醇(分子量4000)和10mM的氯化钙(CaCl₂) 加入到肉汤中，以便原生质体融合。最后，离心肉汤以得到原生质体融合 的酵母。

将所述的原生质体融合的酵母在琼脂培养基中培养6-8天，并对其染 色以检查是否要鉴定原生质体融合的酵母。之后，收集原生质体融合的酵 母，所述的酵母通过染色确认。

优选地，使用的琼脂培养基由3-5wt％的酵母提取物、7-9％的蛋白胨、 7-9wt％的葡萄糖、0.1-0.6wt％的氯化钙、72-75wt％的山梨醇和5-8wt％的 琼脂组成，但不限于上述组成。也可以应用本领域中通常使用的琼脂。

第二个过程：生产对高浓度锗具有高适应性的乙醇抗性酵母(酵母 GP-01，(KCTC 11399BP))，和配制偏锗酸钠溶液(Na₂GeO₃)。

在包含偏锗酸钠(Na₂GeO₃)的培养基中培养在第一个过程中得到的原 生质体融合的酵母以增强酵母对高浓度锗的适应性。

为了生产酵母GP-01(KCTC 11399BP)，由于对锗的适应性，使用偏锗 酸钠(Na₂GeO₃)。将从第一个过程中得到的原生质体融合的酵母在液体培养 基中培养10-13小时，从而使锗的浓度达到3,000-20,000ppm。

优选地，液体培养基由6-10wt％的乙醇、0.1-0.5wt％的蛋白胨、 0.1-0.4wt％的酵母提取物、2-5wt％的葡萄糖、0.1-0.4wt％的麦芽提取物和 84-90wt％的水组成，但不限于上述组成。

优选地，在液体培养基中乙醇的最佳浓度为8-10wt％，偏锗酸钠 (Na₂GeO₃)中锗的含量为3,000-10,000ppm。

在乙醇的浓度低于6wt％或者超过10wt％的情况下，其可以导致难以 获得酵母的最佳量或者难以有效地收集乙醇抗性酵母。而且，在偏锗酸钠 (Na₂GeO₃)中锗的含量小于3,000ppm的情况下，难以有效地收集包含高含 量锗的酵母并且在偏锗酸钠(Na₂GeO₃)中锗的含量超过20,000ppm的情况 下，也很难得到有成本效益的产率。

在液体培养基中，收集了生长活跃并且在培养物的上清液中具有较低 含量锗的酵母。在平板培养基中继代培养收集到的酵母以分离并获得突变 的酿酒酵母，即酵母GP-01(KCTC 11399BP)。

由于所获得的酵母GP-01对乙醇具有高度抗性，因此酵母的产率增加 是可能的。

优选地，以上使用的平板培养基由3-5wt％的琼脂、10-12wt％的酵母 提取物、20-23wt％的蛋白胨、20-23wt％的葡萄糖和39-42wt％的乙醇组成， 但不限于以上组成其中在平板凝固之前加入乙醇。

在酵母的继代培养之后，在室温下对制备的平板进行双重密封以防止 乙醇挥发。

通过向碳酸钠(Na₂CO₃)、碳酸钙(CaCO₃)、碳酸钾(K₂CO₃)或者碳酸氢 钾(KHCO₃)之一中加入相等比例的二氧化锗并进行灭菌来合成本发明中用 作无机锗的偏锗酸钠(Na₂GeO₃)。所得到的偏锗酸钠(Na₂GeO₃)为高溶解度 的锗溶液并且应在生物转化过程中的使用之前立即配制。

在本发明的第二个过程中，为了使酵母发生突变，可以在将酵母在包 含偏锗酸钠(Na₂GeO₃)的培养基中培养之前，额外地将该原生质体融合的酵 母在2.0-2.5KGy(D₁₀值)的γ射线(Co⁶⁰)下辐射，持续2-4小时。

如果γ射线(Co⁶⁰)辐射小于2.0KGy，则由于在平板上形成了突变菌 株的太多菌落，因此很难获得需要的突变酵母。并且，如果γ射线(Co⁶⁰) 辐射大于2.5KGy，则由于酵母的消失率极高，也很难获得需要的突变酵 母。

通过如上所述的γ射线(Co⁶⁰)辐射的突变酵母，在YM肉汤中培养 1小时并稳定之后，可以用于继代培养。

第三个过程：无机锗离子流入酵母GP-01中

为了生产包含高含量有机生物锗的酵母，将第二个过程中所获得的酵 母GP-01与偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液进行培养。

为了生产包含高含量的有机生物锗的酵母(酵母Ge-32K)，将第二个 过程中制备的培养基离心，从而仅收集酵母。并且，通过将收集到的酵母 加入到锗的含量为3,000-10,000ppm的包含偏锗酸钠(Na₂GeO₃)的溶液中制 备包含锗的培养基。

加入的酵母与偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液的体积比为1∶0.5-2.0。

在加入0.01-0.04％的表面活性剂之后，将所获得的包含锗的培养基在 pH 9-10和30-40℃下培养19-21小时。从而生产本发明的包含高含量的有 机生物锗的酵母(酵母Ge-32K)。

加入的表面活性剂可以通过增加的细胞膜通透性，引起细胞中锗的含 量增加。因此，对于将无机锗接种到突变酵母，即酵母GP-01(KCTC 11399BP)中是可能的。

优选地，本发明中使用的表面活性剂为Twin-80，但不限于此。

如果酵母与偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液的混合比例小于1∶0.5或者大于 1∶2，由于包含酵母的悬浮液的高粘度和锗与酵母细胞壁之间的较低的扩散 速度，可以引起酵母中生物锗的含量降低。

而且，如果pH小于9或者大于10，或者温度低于30℃或高于40℃， 可以引起酵母中生物锗的含量降低。

此外，如果加入到包含锗的培养基中的表面活性剂的量低于0.1wt％， 则细胞壁的通透性差。而且，如果加入到培养基中的表面活性剂的量超过 0.4wt％，则由于酵母细胞壁的结构遭到破坏，因此膜的通透性受到抑制。 因此，所述的情况可以导致酵母与未加入表面活性剂的情况具有相同的有 机锗含量。

在通过利用突变的酿酒酵母，即酵母GP-01生产包含高含量的有机生 物锗的酵母，即酵母Ge-32K之后，剩余的包含锗的培养基可以通过采用 0.2μm的膜过滤器进行过滤而再利用。

为了帮助你理解本发明，以下将更加详细地描述本发明的示例性实施 方案。然而，以下的实施例用于解释说明的目的，并且本领域的技术人员 能够理解，在不脱离本发明的范围和精神的情况下有可能进行各种修改、 添加和/或替换，本发明的范围和精神由所附权利要求书和它们的等同替代 形式限定。

制备实施例1：偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液的配制

通过将碳酸钠(Na₂CO₃，Kanto，Japan)溶解在水中，以与所述碳酸钠的 相同比例(1∶1)加入二氧化锗(GeO₂，PPM GmbH，Germany)来配制偏锗酸 钠(Na₂GeO₃)溶液，并对所得到的溶液进行灭菌。

按照前文配制的偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液的溶解度非常高，为500g/L (25℃)。

实施方案1：原生质体融合的酵母的生产，以及通过使用所述原生质体融合的酵母的乙醇抗性酵母的生产。

在30℃下，将韩国典型菌种保藏中心提供的酿酒酵母(KCTC7904)和 乙醇假丝酵母(KCTC7181)在含有YPD培养基的锥形烧瓶(Erlenmeyer  flask)中培养10小时。在酵母的UV分光光度计为0.5的对数早期，离心 制备的培养基以收集酵母。用灭菌生理盐水清洗收集的酵母两次。

在30℃下，将经过清洗的酵母悬浮在1M山梨醇和0.5M巯基乙醇以 1∶2的体积比混合的溶液中30分钟。之后，通过离心，清洗包含酵母的溶 液。

然后，将200个单位的细胞壁降解酶，酵母裂解酶(L4025，sigma，USA) 以1∶1的比例加入到离心清洗的溶液(包含酵母、1M山梨醇和巯基乙醇) 中。在30℃下，将所得到的溶液放置1小时以产生酵母的原生质体。

将由1M山梨醇、聚乙二醇(MW 4000)和10mL的氯化钙(CaCl₂)以 1∶3∶2的体积比组成的溶液以相等的比例加入到上述包含原生质体融合的 酵母中。在30℃下，将该混合的溶液融合30分钟以生产本发明的原生质 体融合的酵母。

为了分离原生质体融合的酵母，在SOS固体培养基中培养原生质体融 合的酵母1周，所述的SOS固体培养基包含4.1wt％的酵母提取物、8.1wt％ 的蛋白胨、8.1wt％的葡萄糖、0.4wt％的氯化钠、73.2wt％的山梨醇和6.1wt％ 的琼脂。在培养1周之后，通过采用苯酚品红(carbol fuchin)对其染色分 离酵母。

在添加30wt％的含有10,000ppm锗的偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液之后， 在YM液体培养基中培养分离的酵母10小时，所述的YM培养基包含 10wt％的乙醇、0.4wt％的蛋白胨、0.2wt％的酵母提取物、4wt％的葡萄糖、 0.2wt％的麦芽提取物和85.2wt％的水。

在液体培养基中，从培养物的上清液中收集生长活跃并且锗的含量较 低的酵母。在包含4.1wt％的琼脂(Difco)、11.1wt％酵母提取物(Genico， Korea)、22.0wt％的蛋白胨(Difco)、22.0wt％的葡萄糖(Daesang，Korea)和 40.8wt％的乙醇的平板培养基中继代培养收集的酵母从而分离并获得突变 的酿酒酵母，即酵母GP-01(KCTC 11399BP)。

为了研究所得到的酵母GP-01的乙醇抗性，按照各浓度加入生长抑制 剂乙醇，并检查了酵母的生长状态。

下文的表1通过乙醇浓度显示了酵母的生长状态，为了准确性，对浓 度的每个值检查三次。

表1

当培养微生物时产生乙醇，但乙醇抑制它们的生长。

如以上表1所示，与缺乏乙醇的情况相比，在乙醇存在的情况下酿酒 酵母，酵母GP-01(KCTC 1139BP)的生长速率增加。在乙醇浓度为6-10％ 的情况下，获得酵母GP-01的最好生长率。

根据本发明，在这种情况下，可以获得在乙醇存在下其生长率增加的 乙醇抗性酵母，即酵母GP-01(KCTC 11399BP)。

此外，通过将本发明的酵母GP-01的产率与最初的酵母(酿酒酵母， KCTC 7904)的产率进行比较，本发明的酵母GP-01(KCTC-11399BP)的产 率增加了超过3倍。

实施方案2：通过偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液的浓度改变酵母GP-01中锗的含量

将包含突变的酿酒酵母，酵母GP-01(KCTC 11399BP)的肉汤培养基进 行离心以收集球团状酵母。将收集到的球团状酵母以1∶1的体积比加入到 偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液中。由于制备了就包含的锗浓度而言的多种偏锗酸 钠(Na₂GeO₃)溶液，配制了在其中加入球团状酵母的多种溶液。将配制的溶 液在pH 10和40℃下培养20小时。

为了确定酵母GP-01中生物锗的含量，将1g经过培养和干燥的酵母 GP-01加入到30ml的硝酸中。加热所得到的样品以使其分解。在将pH值 调节至6之后，将1ml样品与1ml苯基荧光酮和1ml环状核酸混合。所得 到的样品在30℃下静置30小时，然后利用UV分光光度计在525nm处测 定酵母GP-01中锗的含量。

同时，作为对照，进行了与实施方案2中描述的相同的过程，除了采 用二氧化锗(GeO₂)溶液代替偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液之外。

下表2显示了根据偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液与二氧化锗(GeO₂)溶液 中锗的含量，接种到酵母GP-01和最初的酿酒酵母(KCTC 7904)的生物 锗的含量的比较。

表2

通过按照各溶液比较接种的生物锗的含量，表2显示了在溶液中锗的 含量相同的情况下，在二氧化锗(GeO₂)溶液中相比，在偏锗酸钠(Na₂GeO₃) 溶液中接种到酵母中的生物锗的量较多。

而且，通过按照各酵母比较接种的生物锗的量，表2显示了与最初的 酿酒酵母(KCTC 7904)相比，有更多量的生物锗接种到本发明的突变的 酿酒酵母(酵母GP-01，KCTC 11399BP)中。

如果偏锗酸钠(Na₂GeO₃)中锗的含量为3,000-10,000ppm，则有最大量 的无机锗离子被接种到酵母中。此外，溶液中锗的含量为5,000ppm时， 则被接种的锗的产率达到最高。

实施方案3：根据球团状的酵母与无机锗(GeO₂和Na₂GeO₃)溶液的混合比例，比较了酵母GP-01中生物锗的含量。

将包含实施方案1中制备的乙醇抗性酵母GP-01的肉汤进行离心以收 集酵母。将收集的酵母加入到包含偏锗酸钠(Na₂GeO₃)和二氧化锗的溶液 中，所述的溶液具有偏锗酸钠(Na₂GeO₃)和二氧化锗的溶液的不同混合比 例。将所得到的溶液在pH 10和40℃下培养20小时。

同时，作为对照，进行了与实施方案3中描述的相同的过程，除了采 用(无机)二氧化锗(GeO₂)溶液代替偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液之外。

通过与实施方案2相同的方法测定酵母GP-01(KCTC 11399BP)中锗的 含量。

表3显示了随着酵母与二氧化锗(GeO₂)以及酵母与偏锗酸钠 (Na₂GeO₃)的混合比例变化，酵母GP-01中生物锗含量的比较

表3

表3显示了将最大量的生物锗接种到其中酵母和无机锗的混合比例为 1∶0.5-2。此外，当加入偏锗酸钠(Na₂GeO₃)溶液时比加入无机锗(GeO₂) 时生物锗的量增加超过2-4倍。

实施方案4：将无机锗离子接种到酵母中的最佳条件

对包含如实施方案1中制备的乙醇抗性酵母GP-01的肉汤进行离心以 收集酵母。以1∶0.5的比例将收集到的酵母加入到具有5,000ppm锗的偏锗 酸钠(Na₂GeO₃)溶液中。在加入表面活性剂(Twin-80)之后，将所得到的 溶液在pH、温度或者包含锗的肉汤的多种条件下培养20小时。

通过利用1N NaOH调节pH，并在不同的温度和表面活性剂浓度下重 复进行大量的测试。

当测定锗的含量时，将未添加表面活性剂的肉汤用作对照。

通过与实施方案2相同的方法测定本发明的酵母GP-01(KCTC 11399BP)中生物锗的含量。

表4显示了通过pH、温度和表面活性剂(Twin-80)浓度的变化，接 种到酵母中的锗离子的含量。

表4

表4显示了用于将无机锗接种到酵母中的最佳条件由pH 8-10、温度 30-40℃和在包含锗的肉汤中0.1-0.4wt％的表面活性剂组成，更优选地，由 pH10、温度40℃和0.2wt％的表面活性剂组成。

在所附的图2、3和4中显示根据pH、温度和无机锗的浓度，接种的 生物锗的含量的变化。