STINg-IRF3信号通路介导血管和脂肪组织炎症机制探索

摘要

研究背景:
　　血管并发症是现在代谢综合征病人的首要致死致残因素。研究证明，内皮细胞作为维持血管结构和功能完整性的基本单元，其激活和炎症状态时血管并发症发生发展的重要起始步骤。而代谢综合征病人体内升高的代谢压力正是引起内皮细胞激活的主要原因。但是迄今为止，内皮细胞激活/炎症的具体机制仍然不明确，所以研究代谢应激下内皮细胞激活/炎症的机制对于未来开发血管并发症防治措施有重要意义。
　　多种遗传或环境因素参与了代谢综合征的发生发展，内质网应激作为外界刺激的感受器和放大器，调节了细胞内的一系列信号通路的激活。生理情况下，细胞处于代谢稳态，内质网伴侣蛋白Bip(Grp78)与ATF6、IRE1、PERK等激酶结合并抑制其活性。一旦给予细胞代谢压力，UPR(Unfolded ProteinResponse)被激活，导致Bip与ATF6、IRE1、PERK等激酶脱离，进而引起下游一系列应激通路的激活。
　　线粒体作为细胞内的能量生成器，除了为机体合成ATP外，还能够调节细胞氧化还原和信号转导。线粒体DNA(mtDNA)是位于线粒体内的含有37个线粒体基因的环状DNA分子。由于mtDNA无内含子和组蛋白，而且容易暴露于高水平的活性氧环境下，所以mtDNA突变频率较核基因组高10倍以上。而且一旦线粒体膜完整性受到破坏，mtDNA易被释放入细胞浆，进而被DNA感受器识别，激活下游通路。
　　STING(stimulator of interferon genes， TMEM173)作为免疫和炎症中的一个重要信号分子，首先被认为是病毒感染过程中宿主免疫反应的重要分子。STING能够识别病毒释放到宿主胞浆内的DNA，从而招募TBK1(Tank-binding kinase1)和转录因子IRF3(interferon regulatory factor)形成复合物，并移位至细胞核周围。在此过程中IRF3被TBK1磷酸化，形成二聚体结构并进入细胞核。进入细胞核的IRF3与目的基因（IFNα，IFNβ等）的启动子结合，促进炎症基因的表达。近期有报告表明STING-IRF3信号通路能够被内质网应激(ER stress)和线粒体损伤(mi tochondri al damage)激活，但其具体机制仍不明确。2014年新英格兰杂志报道了一种发病于婴儿期的STING相关血管病变(SAVI，STING-associated vasculopathy with onset ininfancy)，表现为STING过度激活伴随内皮细胞炎症。表明STING与内皮细胞炎症之间存在关联。
　　研究目的:
　　研究STING-IRF3信号通路在棕榈酸(palmitic acid，PA)诱导的内皮细胞炎症中发挥的作用;阐明IRF3调节内皮细胞炎症的分子机制;探讨内质网应激和线粒体损伤/mtDNA在PA诱导STING-IRF3信号通路激活中的作用;活体实验观察STING-IRF3信号通路对代谢综合征慢性炎症的影响。
　　研究方法:
　　(1)棕榈酸(PA)处理对内皮细胞炎症的影响:将棕榈酸融入20％牛血清白蛋白(BSA)溶液后制成0-4mM的PA储存液(10X)。使用细胞培养基ECM将PA储存液稀释至终浓度(0-0.4mM)后处理人主动脉内皮细胞相应时间，用于后续试验。
　　(2)细胞转染:下调细胞内相应基因表达时，使用lipofectamine2000或Jetprime试剂盒瞬时转染siRNA6小时后给予后续处理。
　　(3)Western blot实验:处理后细胞或速冻组织使用Western及IP细胞裂解液裂解，确定蛋白浓度后高温变性。使用SDS-PAGE胶进行凝胶电泳，免疫印迹检测目的蛋白的表达水平。
　　(4)Real-time RT-PCR:处理后细胞使用TRIzol法提取总RNA，逆转录后进行实时定量PCR，检测ICAM-1 mRNA表达水平的改变。
　　(5)免疫荧光显微技术:细胞接种于含有细胞爬片的6孔板培养至相应细胞密度，给予指定处理后进行固定、封闭，然后依次加入一抗和二抗孵育，激光共聚焦显微镜观察STING、IRF3等关键分子在细胞内的定位情况。
　　(6)免疫共沉淀(Co-IP):未变性的全细胞裂解液去除非特异性结合后，加入STING或IRF3抗体过夜孵育后加入protein A+G agarose beads共同孵育，免疫沉淀产物变性后使用SDS-PAGE进行凝胶电泳，免疫印迹检测Bip是否与STING存在生理学上的相互作用。
　　(7)染色质免疫共沉淀(Chip):细胞接种于10cm2细胞培养皿并给予相应处理后，使用1％多聚甲醛交联后给予SDS裂解，超声粉碎，IRF3 pulldown和DNA提取后，进行实时定量PCR，比较IRF3与ICAM-1 promotor结合是否改变。
　　(8)动物模型:野生型小鼠和STING缺陷小鼠分别给予三个月高脂饮食后安乐死、取材。使用OCT包埋脂肪组织，切片，进行后续免疫荧光观察。
　　(9)统计学分析:P＜0.05被认为差异有统计学意义。
　　研究结果:
　　1.棕榈酸能够引起内皮细胞炎症激活:
　　(1)使用Western blot检测，梯度棕榈酸PA处理人主动脉内皮细胞24小时能够明显增加内皮细胞黏附分子ICAM-1蛋白水平。
　　(2)梯度棕榈酸PA处理人主动脉内皮细胞24小时能够明显上调磷酸化IRF3的水平。
　　(3)病理剂量的棕榈酸PA处理人主动脉内皮细胞24小时能够观察到明显的STING向细胞核周围移动，并且伴随IRF3移位至细胞核。
　　(4)梯度棕榈酸PA处理人主动脉内皮细胞24小时能够能够明显增加内皮细胞与人单核细胞细胞系THP-1细胞的粘附。
　　(5)使用Real-time RT-PCR检测结果显示使用病理剂量的棕榈酸PA处理人主动脉内皮细胞6小时后，黏附分子ICAM-1 mRNA水平升高约2.5倍。
　　2.下调STING蛋白水平对STING-IRF3信号通路和内皮细胞炎症的影响:
　　(1) Western blot结果显示下调STING表达可以显著逆转棕榈酸诱导的IRF3磷酸化。
　　(2)细胞免疫荧光结果显示下调STING表达可显著逆转棕榈酸诱导的IRF3移位。
　　(3) Western blot结果显示下调STING表达可显著下调棕榈酸诱导的ICAM-1蛋白高表达。
　　(4) Real-time RT-PCRR结果显示下调STING表达可显著下调棕榈酸诱导的ICAM-1 mRNA高表达。
　　(5)单核细胞粘附实验结果表明下调STING表达可以显著减少内皮细胞与单核细胞的粘附。
　　3.下调转录因子IRF3蛋白水平对于内皮细胞炎症的影响:
　　(1) Western blot实验结果表明下调转录因子IRF3表达可显著逆转棕榈酸诱导的ICAM-1蛋白水平升高。
　　(2) Real-time RT-PCR实验结果表明下调IRF3表达能够显著逆转棕榈酸诱导的ICAM-1 mRNA水平升高
　　(3)分析ICAM-1基因启动子结构，结果显示ICAM-1基因启动子内有IRF3的结合位点。
　　(4)染色质免疫共沉淀实验结果显示棕榈酸能够诱导IRF3与ICAM--1启动子结合明显增加，下调STING蛋白水平可显著逆转IRF3与ICAM-1启动子的结合。
　　(5)单核细胞粘附实验结果表明下调IRF3蛋白水平能够显著逆转棕榈酸诱导的内皮细胞与单核细胞粘附。
　　4.内质网应激可能参与了棕榈酸诱导的STING-IRF3通路激活:
　　(1) Western blot结果显示棕榈酸PA处理人主动脉内皮细胞能够引起明显的内质网应激。
　　(2) Western blot结果同样确认了内质网应激激活剂毒胡萝卜素/DTT能够引起明显的内质网应激。
　　(3)细胞免疫荧光实验表明DTT处理内皮细胞能够引起明显的STING核周移位和IRF3核移位。
　　(4) Western blot结果显示毒胡萝卜素/DTT处理内皮细胞能够引起明显的IRF3磷酸化和ICAM-1蛋白水平升高。
　　5.Bip-STING相互作用介导了棕榈酸引起的STING-IRF3信号通路激活:
　　(1)免疫共沉淀实验表明正常内皮细胞内STING与Bip能够相互结合。棕榈酸、毒胡萝卜素或DTT处理能够减少两者的相互结合。
　　(2)细胞免疫荧光实验表明毒胡萝卜素处理内皮细胞可以引起STING脱离内质网，并与EEA1或TFR阳性囊泡结合，移位至细胞核周围。
　　(3)细胞免疫荧光实验表明下调Bip表达能够明显促进STING向核周移位。
　　(4) Westernblot实验结果显示下调Bip表达能够明显增加IRF3磷酸化及ICAM-1蛋白水平。
　　(5) Real Time RT-PCR结果确认下调Bip表达能够明显上调ICAM-1的mRNA水平。
　　6.线粒体损伤和线粒体DNA释放对于STING-IRF3信号通路激活的影响:
　　(1)细胞免疫荧光实验表明棕榈酸处理内皮细胞后线粒体结构发生变化，胞浆内双链DNA(dsDNA)明显增加。
　　(2)使用Real Time RT-PCR实验证明，棕榈酸处理内皮细胞后，可以引起胞浆内线粒体DNA数量显著增加。
　　(3)免疫共沉淀实验结果表明，使用线粒体DNA处理内皮细胞后能够引起Bip-STING的结合减少。
　　(4)细胞免疫荧光实验表明线粒体DNA处理内皮细胞后能够引起STING核周移位及IRF3核移位。
　　(5) Western blot实验结果表明给予内皮细胞线粒体DNA刺激，能够引起IRF3磷酸化水平升高和ICAM-1蛋白水平升高。
　　(6)免疫共沉淀实验结果表明，使用线粒体损伤剂CCCP刺激细胞后，同样能够减少Bip-STING结合。
　　(7)细胞免疫荧光实验表明给予内皮细胞线粒体损伤剂CCCP或rotenone后，STING、IRF3同样出现明显移位。
　　7.胞浆DNA识别蛋白cGAS可能在棕榈酸诱导的内皮细胞中发挥作用。Western blot实验结果表明，棕榈酸能够诱导内皮细胞cGAS(cGAMP合成酶)蛋白水平升高。同时下调cGAS表达能够逆转棕榈酸诱导的STING-IRF3信号通路激活和ICAM-1蛋白高表达。
　　8.在STING缺陷小鼠中证明STING-IRF3信号通路对于内皮细胞炎症的影响:
　　(1) Western blot结果显示高脂饮食能够明显上调脂肪组织内IRF3磷酸化水平和ICAM-1蛋白水平;而STING缺陷能够逆转高脂饮食引起的IRF3磷酸化和ICAM-1高表达。
　　(2)组织免疫荧光结果显示高脂饮食能够诱导小鼠脂肪组织血管内皮细胞内ICAM-1表达明显增加，而STING缺陷能够显著减少ICAM-1的表达。
　　(3)组织免疫荧光结果显示高脂饮食能够诱导小鼠脂肪组织血管内CD68+细胞浸润增加，而STING缺陷能够显著减少CD68+细胞浸润。
　　(4) HE染色结果显示给予高脂饮食后小鼠脂肪组织中冠状结构(crown likestructure)明显增加，而STING缺陷后能够显著逆转冠状结构的数量。
　　(5) Masson染色结果显色高脂饮食能够诱导小鼠脂肪组织胶原沉积增加，而STING缺陷能够显著改善胶原沉积。
　　(6) STING缺陷能够改善高脂饮食引起的体重增加、游离脂肪酸水平升高和胰岛素抵抗。
　　结论:
　　(1)棕榈酸能够通过激活STING-IRF3信号通路诱导内皮细胞炎症。
　　(2)内质网应激和线粒体损伤/线粒体DNA释放介导了棕榈酸引起的STING-IRF3信号通路激活。
　　(3)内质网应激和线粒体损伤/线粒体DNA释放共同调节Bip-STING结合，进而调控STING-IRF3信号通路激活。
　　(4) STING-IRF3信号通路在高脂饮食诱导的脂肪组织炎症中发挥重要作用。
　　(5) STING缺陷能够改善肥胖小鼠脂肪组织炎症、胰岛素抵抗及葡萄糖耐量。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

材料与方法

一、实验材料

二、实验方法

结果

1．棕榈酸处理能够诱导STING-IRF3信号通路激活和内皮细胞激活／炎症

2．STING参与棕榈酸诱导的内皮细胞炎症和ICAM-1表达

3．转录因子IRF3能够直接结合至ICAM-1启动子并促进其表达，进而调节内皮细胞炎症

4．内质网应激能够诱导内皮细胞STING-IRF3信号通路激活

5．内质网应激能够引起STING与Bip分离

6．线粒体损伤与胞浆DNA参与了棕榈酸诱导的STING-IRF3信号通路激活

7．胞浆DNA识别蛋白cGAS可能在棕榈酸诱导的内皮细胞中发挥作用

8．STING蛋白在高脂饮食诱导的脂肪组织血管炎症和胰岛素抵抗中发挥了重要作用

讨论

结论

附图

参考文献

致谢

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