结直肠癌中miR--21对TET1的靶向调控关系及其对癌细胞生物学行为影响的研究

摘要

MicroRNA(miRNA)是一种内源性非编码的单链小RNA，广泛存在于生物基因组中。它能与目标mRNA的3'非翻译区域(3'-UTRs)进行配对并结合，不完全降解mRNA或抑制mRNA的翻译，参与调控了一半以上的基因表达。此外，miRNA是重要的转录后调节因子，在细胞增殖、分化、凋亡、组织发育、肿瘤发生等生理过程中发挥着广泛而重要的作用。鉴于之前的研究表明TET1参与抑制CRC细胞的生长，假设TET1在转录后水平上受miRNA调控。在我们的研究中，发现与CRC患者的癌旁邻近组织样本相比，CRC患者的癌组织样本中miR-21的表达上调，而TET1的表达明显下降。此外，我们的研究结果表明，miR-21通过靶向作用于TET1促进结直肠癌细胞的增殖、侵袭与迁移。 第一部分 结直肠癌组织中miR-21和TET1的表达情况及二者相关性研究 目的：研究结直肠癌组织中miR-21和TET1的表达情况及相互关联 方法：采用生物信息学的方法预测miR-21可靶向作用于TET1。收集2016-2017年间在山东大学附属省立医院胃肠外科由同一手术团队确诊并行根治性手术的结直肠癌患者50例。取其肿瘤组织细胞及对应的切缘肿瘤检测阴性的正常结直肠组织细胞，采用新鲜冰冻样本进行miR-21和TET1表达分析。使用qRT-PCR分析50对临床CRC和邻近的非癌组织中miR-21和TET1mRNA的表达情况，并通过内源性对照对其进行标准归一化处理，分析二者表达差异，并进一步评估了miR-21和TET1表达之间的相关性。 结果：目前用于预测miRNA靶基因的网站软件有很多，如miRBase、TargetScan和starbase等，选择在线应用多个生物信息学预测软件对miR-21的靶基因进行预测，将3各数据库的预测结果取交集，预测得出miR-21可信度和准确性较高的靶基因。结合既往的研究结果，选择其中最有可能并且与肿瘤有一定关系的一个靶基因进行验证。筛选出的靶基因为TET1。然后，使用qRT-PCR分析50对临床CRC和邻近的非癌组织中TET1mRNA的表达，并参照内源性对照(GAPDH)进行标准归一化处理。结果显示，与相应的邻近组织相比，50例CRC患者的肿瘤组织中TET1mRNA的表达水平较低，差异具有统计学意义(P＜0.05)。同样检测了miR-21的表达水平，发现CRC患者的肿瘤组织中miR-21的表达水平较对应的邻近组织高，差异同样具有统计学意义(P＜0.05)。然后评估了miR-21和TET1mRNA相对表达水平之间的相关性。不出所料，发现在CRC组织中miR-21水平与TET1mRNA水平呈显著负相关(Pearson相关系数r=-0.409，P=0.0032)。总的来说，我们的发现表明，与相应的邻近组织相比，50例CRC患者的肿瘤组织中TET1mRNA表达水平较低，而miR-21的表达水平较高。同时，发现miR-21水平与TET1mRNA水平呈显著负相关。 结论：与相应的邻近组织相比，结直肠癌组织中miR-21高表达而TET1mRNA低表达，且二者表达水平呈显著负相关。 第二部分 体外实验证实TET1是miR-21的靶基因及其调控关系研究 目的：体外实验证实miR-21可靶向作用于TET1mRNA的3'-UTRs，抑制CRC细胞中TET1的表达。 方法：将预测与miR-21相互作用的TET1mRNA的3'-UTRs序列或与预测目标位点相互作用的突变序列插入pmirGLO载体中(Promega，USA)。它们分别被命名为pmirGLO-TET1-wt和pmirGLO-TET1-mut。向结直肠癌细胞株HCT15和HT29共转染hsa-miR-21mimics(miR-21)/NC(miR-control)和pmirGLO-TET1-wt/pmirGLO-TET1-mut，使用荧光素酶检测设备检测转染后细胞的荧光素酶活性，根据检测结果判断miR-21与TET1mRNA的3'-UTRs是否相结合。为了进一步研究miR-21对TET1表达的影响，在HCT15和HT29细胞中进行了miR-21和抗miR-21的瞬时转染，使用qRT-PCR分析转染后miR-21和TET1mRNA的表达情况。同时，使用蛋白印迹的方法检测转染后TET1蛋白的表达水平。 结果：荧光素酶报告基因分析显示，在HCT15细胞中miR-21与pmirGLO-TET1-wt反应组较其余三组（miR-21与pmirGLO-TET1-mut组、miR-control与pmirGLO-TETl-wt组、miR-control与pmirGLO-TET1-mut组）的萤火虫荧光素酶活性明显偏低(P＜0.05)，而其余三组无明显差异。在HT29细胞中也产生了同样的实验结果。实验表明miR-21以剂量依赖性的方式显著抑制pmirGLO-TET1-wt的萤火虫荧光素酶活性，而当靶位点在HCT15和HT29细胞中发生突变时，miR-21则不能发挥作用，这就证实了miR-21可靶向作用于TET1mRNA的3'-UTRs。瞬时转染实验的数据显示，与对照组HCT15和HT29细胞中的miR-21相比，实验组在转染miR-21后引起miR-21表达上调，并导致TET1mRNA水平明显降低，而转染抗miR-21后引起miR-21表达下调，并导致TET1mRNA水平明显升高。当CRC细胞中miR-21的表达升高时，TET1蛋白水平显著降低，而抑制两种CRC细胞中miR-21的表达时，TET1蛋白水平显著升高。总的来说，我们的实验表明，在CRC细胞中miR-21可靶向作用于TET1mRNA的3'-UTRs并引起TET1的表达下调。 结论：TET1是CRC细胞中miR-21的一个靶基因，miR-21能够引起CRC细胞中TET1的表达下调。 第三部分 MiR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响 目的：探讨miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的增殖、侵袭及迁移能力的影响 方法：根据之前研究结果，miR-21能够下调CRC细胞中的TET1表达。而最近的研究发现，与正常组织相比，在结直肠肿瘤组织中，TET1表达显著减少，癌细胞的扩散与TET1的沉默有关。因此，进一步研究miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响。通过向CRC细胞转染抗miR-21，降低miR-21的表达而抬高TET1表达，然后再转染si-TET1从而敲低TET1的表达，研究细胞增殖、侵袭和迁移能力的变化。本实验在两种结直肠癌细胞株HCT15和HT29中转染抗miR-21、抗miR-21+si-TET1及相应对照，使用qRT-PCR方法检测转染后各组miR-21和TET1mRNA表达水平，使用Western blot检测TET1蛋白表达水平。然后选用EdU检测和CCK-8分析验证miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的增殖能力的影响，选用Transwell实验验证miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的侵袭能力的影响，选用细胞划痕实验验证miR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞的迁移能力的影响。 结果：在两种结直肠癌细胞株HCT15和HT29中转染抗miR-21、抗miR-21+si-TET1及相关对照后使用qRT-PCR、Western blot检测各组miR-21和TET1表达水平及TET1蛋白表达水平。结果显示在两组CRC细胞株中转染抗miR-21组细胞较对照组miR-21表达下调，TET1mRNA水平明显升高，TET1蛋白表达水平升高;转染抗miR-21+si-TET1组细胞较对照组miR-21表达下调，TET1mRNA和TET1蛋白表达水平均无明显差异，而较抗miR-21组细胞TET1mRNA和TET1蛋白表达水平均明显降低。实验表明抗miR-21转染后降低了miR-21的表达，上调了TET1的表达;而同时转染抗miR-21+si-TET1后降低了miR-21的表达，但TET1的表达无明显上调。细胞转染达到了预期效果后，进一步检测转染后细胞生物学行为的变化。 EdU检测显示，抗miR-21组细胞较对照组及抗miR-21+si-TET1组细胞增殖明显降低(P＜0.05)，而抗miR-21+si-TET1组细胞与对照组细胞增殖能力无统计学差异。CCK-8分析表明，在HCT15和HT29细胞中使用抗miR-21处理后，CRC细胞的增殖能力较对照组显著降低，而对照组和用抗miR-21+si-TET1同时处理组则无统计学差异。Transwell实验表明，抗miR-21处理后细胞侵袭能力较对照组显著降低，而对照组和用抗miR-21+si-TET1同时处理组则无统计学差异。细胞划痕实验表明，抗miR-21处理后细胞迁移能力较对照组显著降低，而对照组或用抗miR-21+si-TET1同时处理组则无统计学差异。实验结果说明在两种结直肠癌细胞株HCT15和HT29中，抗miR-21处理后TET1高表达使得细胞增殖、侵袭及迁移能力均降低，但通过同时与抗miR-21和si-TET1作用使得TET1低表达，可以抵消抗miR-21介导的HCT15和HT29细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用。实验结果表明miR-21影响细胞增殖、侵袭和迁移部分依赖于TET1的作用。 结论：miR-21可以通过靶向作用于CRC细胞中的TET1来促进细胞增殖、侵袭及迁移。

目录

声明

摘要

符号说明

前言

第一部分结直肠癌组织中miR-21和TET1的表达情况及二者相关性研究

材料与方法

结果

讨论

第二部分体外实验证实TET1是miR-21的靶基因及其调控关系研究

材料和方法

结果

讨论

第三部分MiR-21调控TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

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