TETs表达与结直肠癌发生发展的关系及TET1表达对结直肠癌细胞生物学行为的影响

摘要

目的：
　　表观遗传在生命发育和疾病发生中起重要的作用，通过DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色体重塑及非编码RNA等途径，在不改变DNA序列的情况下，激活或抑制基因的表达，使转录组发生可逆可遗传的变化。DNA甲基化异常在肿瘤的发生发展中起到非常重要的作用。DNA甲基化修饰分为从头甲基化和维持甲基化两种途径，通过DNA甲基转移酶（DNMT1和DNMT3a、DNMT3b），将甲基基团转移到胞嘧啶(C)，从而生成5-甲基胞嘧啶（5-mC）。近年来的研究发现，哺乳动物体内存在多种DNA去甲基化途径，使DNA甲基化水平呈动态变化。一方面通过复制依赖的“被动去甲基化”途径，即在复制分裂时期，阻止新链发生甲基化修饰而达到去加甲基化的效果。另一方面，还存在专门的去甲基化途径，即“主动去甲基化”。“被动去甲基化”过程已经得到广泛证实和认可，而“主动去甲基化”途径所涉及的酶仍不清楚。直到2009年，才发现TET1作为去甲基化的关键酶，可催化5-mC生成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，从而酶活性介导的主动去甲基化过程才得以广泛研究。TET(Ten-Eleven translocation)蛋白，具有加双氧酶活性，在Fe2-和2-酮戊二酸(2-OG)的条件下，可以连续氧化5-mC分别生成5-hmC，5-甲酰胞嘧啶（5-fC）和5-羧基胞嘧啶(5-CaC)，从而完成DNA的去甲基化。过去研究发现，肿瘤组织中5-mC、5-hmC及TET蛋白的水平均低于正常组织，但其水平的变化对肿瘤发生发展的影响还不清楚。因此我们从以下三个方面，分别探讨结直肠癌中TETs和5-mC、5-hmC水平的变化对结直肠癌发生发展的影响:1.检测结直肠癌肿瘤组织和正常组织中TETs的表达情况并分析其与病人预后的关系;2.检测基因组总5-mC、5-hmC的水平并分析其与病人临床病理参数、生存预后的相关性;3.TET1表达改变对结直肠癌细胞生物学行为的影响。
　　第一部分 结直肠癌肿瘤组织与正常组织中TETs基因表达的差异及与病人预后关系的研究
　　方法：收集2006-2012年浙江省台州医院109例结直肠癌患者的肿瘤组织和正常组织（取自癌旁）、相关临床资料。利用QuantiGenePlex assay检测组织中TET1、TET2和TET3基因mRNA的表达。比较TETs基因在肿瘤组织和正常组织表达差异，分析TETs表达与临床病理参数、病人预后的关系。
　　结果:TET1和TET2在结直肠癌肿瘤组织中的表达显著低于正常组织:肿瘤组织中TET1的中位数是0.02，明显低于正常组织的表达（中位数，0.06），（P＜0.01);TET2在肿瘤组织中的中位数是0.22，同样低于其在正常组织中的表达（中位数，0.31），（P＜0.01）。但是，肿瘤组织中TET3表达(中位数，0.36)明显高于正常组织（中位数，0.22）(P＜0.01)。按病人年龄、性别、肿瘤发生的部位、TNM分期、肿瘤浸润的深度、淋巴结转移和远处转移分亚组后，也得到相同结果（P均＜0.05）。生存分析发现，TET1在肿瘤组织与正常组织水平的比值(C/N-TET1)高的病人，平均生存时间为40.2月，五年生存率是44％，远短于C/N-TET1水平低的病人（平均生存时间为49.5月，五年生存率是69％）。采用多因素COX比例风险模型，校正年龄、性别、TNM分期后，发现高水平的C/N-TET1的相对危险度(HR)是2.5，95％的可信区间(CI)是1.34-4.66（P＜0.01）。因此，TET1在肿瘤组织与正常组织水平的比值(C/N-TET1)，可作为独立的预后危险因素用以评估病人的预后。
　　第二部分 结直肠癌肿瘤组织与正常组织中基因组总体5-mC、5-hmC的水平差异及与病人预后关系的研究
　　方法：109例结直肠癌病人中，我们抽提了71例病人肿瘤组织和相应正常组织的DNA。采用ELISA方法，检测142例样本中基因组总5-mC、5-hmC的水平，比较5-mC、5-hmC在肿瘤组织和正常组织水平的差异，分析5-mC、5-hmC水平与TETs表达、临床病理参数以及生存预后的关系，并根据C/N-5mC和C/N-5hmC的水平对病例进行分层，在不同分层中分析与生存预后的关系。
　　结果:肿瘤组织中基因组总5-mC和5-hmC的水平明显低于正常组织:肿瘤组织中，5-mC的中位数是4.46％，低于正常组组织的中位数6.15％;肿瘤组织中，5-hmC水平的中位数是0.05％，远低于正常组织的中位数0.07％（P均＜0.01)。按病人年龄、性别、肿瘤发生的部位、TNM分期、肿瘤浸润的深度、淋巴结转移和远处转移分亚组后，也得到相同结果（P均＜0.05）。但是5-mC和5-hmC同TET蛋白表达之间无相关性（P均＞0.05）。在临床病理参数的分析中发现，大于60岁或肿瘤浸润T4期的病人，C/N-5mC水平低(P＜0.05)。生存分析发现， C/N-5mC高的病人，五年生存率为80％，高于C/N-5mC低的病人（五年生存率为50％），多因素COX比例风险模型校正年龄、性别、TNM分期后，发现高水平的C/N-5mC的相对危险度为0.36，95％的可信区间为0.13-0.96，因此C/N-5mC可作为独立的保护性因素提示病人预后。根据C/N-5mC和C/N-5hmC的水平对病例进行分层，发现同时具有高水平的C/N-5hmC和低水平的C/N-5mC的病人，预后最差(HR=3.48,95％CI=1.54-7.88)。
　　第三部分 TET1表达改变对结直肠癌细胞生物学行为的影响
　　方法：根据前面研究发现，TET1表达异常可能参与了结直肠癌的发生发展。于是我们在细胞系中探讨TET1的生物学功能。我们检测了7株结直肠癌细胞系TET1的表达情况，在高表达TET1的SW620细胞中，采用慢病毒感染的方法，构建敲除TET1的细胞系;在低表达TET1的HCT116细胞中，采用脂质体转染的方法，构建过表达TET1的细胞系。随后在构建的细胞系中采用ELISA检测基因组总5-mC和5-hmC的水平，采用Cell Counting Kit-8(CCK-8试剂盒)检测细胞增殖，以及采用Transwell小室实验检测细胞的迁移和侵袭能力。
　　结果:TET1在SW620细胞中表达相对较高，而在其他六株细胞系（HT29，HCT116，HCT8，RKO，DLD1和SW480）的表达水平都相对较低;不同于组织中TETs和5-mC、5-hmC的关系，在敲除TET1的SW620细胞系中发现，基因组5-mC水平升高，而5-hmC水平降低。TET1的缺失使细胞增殖能力增强，但抑制了细胞侵袭和转移能力;在过表达TET1的HCT116细胞系中，细胞的侵袭和转移能力增强。这表明TET1可能对基因组的甲基化水平有影响，而TET1在肿瘤的发生中，不仅作为抑癌基因抑制肿瘤的增殖，可能还发挥着促进肿瘤转移的作用。
　　结论：TETs基因的表达与结直肠癌的发生、发展有关。TET1可以抑制细胞的增殖、促进细胞的迁移和侵袭。藉此完善了TET1在结直肠癌中的生物学作用。

目录

声明

致谢

摘要

缩略语

引言

仪器设备和试剂

1 仪器设备

2 主要生物化学试剂

3 主要抗体

4 所用材料及溶剂配方

第一部分 结直肠癌肿瘤组织与正常组织TETs基因表达的差异及与病人预后关系的研究

1 材料和方法

2 实验结果

第二部分 结直肠癌肿瘤组织与正常组织中，基因组总体5-mC、5-hmC的水平差异及与病人预后关系的研究

1 材料和方法

2 实验结果

第三部分 TET1表达改变对结直肠癌细胞生物学行为的影响

1 材料和方法

2 实验结果

讨论

结论

参考文献

综述

作者简历及在读期间所取得科研成果