基于DNA分子机器和RNA自发转录的RNA传感器

摘要

本研究中，通过将RNA转录过程与传统的DNA分子机器过程连接耦合，建立了3种新型的RNA传感器，以实现对RNA的高灵敏度检测。通过不同的耦合方式，共建立了三种基于DNA循环放大体系或DNA聚合-RNA转录联用的放大机制，以实现对信号的放大:接受输入的低浓度RNA，输出浓度对输入构成放大的DNA或RNA，并通过相应的方式对输出核酸链进行检测。
　　首先在体系一中建立了一个DNA聚合和RNA转录联用的分子机器。该联用过程可以孔雀石绿标记DNA，建立了一个集成DNA聚合和RNA转录过程，能够重复产生RNA适体片段，并结合孔雀石绿产生荧光信号的分子机器，以实现对DNA的高灵敏度检测。分子机器由直链探针构成。当有引发DNA存在的情况下，直链DNA会与其结合，形成引发体。在DNA聚合酶的催化下，发生DNA聚合，形成一条以直链DNA序列与其互补链组成的双链模板。该模板上带有RNA转录所需的启动子序列，在RNA转录酶的催化下，能够引发DNA转录反应。转录反应连续进行，产生的大量孔雀石绿适体序列被释放到溶液中，并可以与孔雀石绿结合产生荧光，实现信号的放大。研究中主要探索了DNA聚合-RNA转录的最适条件，以及引发DNA与荧光响应的关系。
　　其次在体系二中建立了一个DNA聚合与RNA转录联用的分子机器，利用荧光DNA来标记RNA，以便检测通过DNA聚合-RNA转录得到的RNA，建立了一个集成DNA聚合和RNA转录过程，能够重复产生RNA适体片段，并替直链探针上的荧光DNA从而产生荧光信号的分子机器，并探索此分子机器在检测RNA方面的应用。本分子机器分为两部分，反应部分和报告部分。在反应部分，以靶RNA为输入条件，以一个特殊设计的探针为反应模板模板引发一个自发连续的DNA-RNA连续反应循环，重复产生大量RNA链;这些RNA链进入报告部分，通过杂交替换反应从一个报告探针上替换下带有荧光DNA序列，释放到溶液中。这样通过转录重复产生的大量RNA适体序列被释放到溶液中，并替换报告探针上的荧光DNA，实现信号的放大。主要探索了DNA聚合-RNA转录联用分子机器的最适条件，以及靶RNA与荧光响应之的关系。
　　最后在体系三中建立了一个DNA剪切循环放大过程，能够剪切产生大量的DNA片段，并替换报告探针上的荧光DNA从而产生荧光信号的分子机器，并探索此分子机器在检测RNA方面的应用。本分子机器分为两部分，反应部分和报告部分。在反应部分，以靶RNA为输入条件，以一个特殊设计的探针为反应模板模板引发一个自发连续的DNA聚合-剪切反应网络，重复产生大量信号DNA链;这些信号DNA链进入报告部分，通过杂交替换反应从一个报告探针上替换下带有荧光DNA序列，释放到溶液中。这样通过剪切产生的大量DNA适体序列被释放到溶液中，并替换报告探针上的荧光DNA，实现信号的放大。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 核酸适体的生物传感器

1．1．1 适体简介

1．1．2 适体的特点

1．1．3 适体应用进展

1．2 DNA简介

1．2．1 DNA的组成

1．2．2 DNA的结构

1．2．3 DNA的变性与复性

1．3 RNA简介

1．3．1 RNA的组成

1．3．2 RNA的转录

1．3．3 DNA自组装上接RNA

1．3．4 RNA的自催化

1．3．5 T7 RNA聚合酶

1．4 限制性内切酶

1．4．1 限制性内切酶简介

1．4．2 限制性内切酶作用

1．4．3 酶切分析应用

1．5 孔雀石绿

1．5．1 孔雀石绿简介

1．5．2 孔雀石绿适体序列的结合

1．6 立题依据及研究内容

第二章 DNA聚合与RNA转录联用分子机器的改进研究

2．1 实验部分

2．1．1 材料和试剂

2．1．2 实验仪器

2．1．3 DNA聚合-RNA转录以及与孔雀石绿的结合

2．2 结果与讨论

2．2．1 RNA适体与孔崔石绿反应需要的缓冲溶液的探索

2．2．2 酶促反应液对荧光信号的影响

2．2．3 Klenow聚合酶用量对荧光信号的影响

2．2．4 T7 RNA聚合酶用量对荧光信号的影响

2．2．5 反应时间对荧光信号的影响

2．2．6 引发DNA用量对荧光信号的影响

2．3 结论

第三章 通过DNA聚合-RNA转录联用分子机器进行RNA的高灵敏度检测

3．1 实验部分

3．1．1 材料和试剂

3．1．2 实验仪器

3．1．3 探针的制备

3．1．4 聚合体系反应

3．1．5 检测

3．2 结果与讨论

3．2．1 复制条件的探讨

3．2．2 复制体系工作曲线

3．3 小结

第四章 通过DNA聚合剪切放大体系提高RNA的检测灵敏度

4．1 实验部分

4．1．1 材料和试剂

4．1．2 实验仪器

4．1．3 探针的制备

4，1．4 聚合体系反应

4．1．5 检测

4．2 结果与讨论

4．2．1 复制条件的探讨

4．2．2 复制体系工作曲线

4．3 小结

参考文献

结论

致谢

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