凝血酶和凝血因子Xa在Meg-01细胞分化为血小板中的作用及其机制

摘要

凝血酶和凝血因子Xa(FXa)是凝血系统中重要的两个凝血因子，本研究分别探讨凝血酶和凝血因子Xa对Meg-01细胞分化为血小板的作用机制。
　　凝血酶是一种有丝分裂原，可以诱导多种细胞功能。我们先以凝血酶为激动剂，研究了凝血酶在Meg-01细胞分化为血小板样颗粒中的作用及其机制。使用TPO作为阳性对照，采用CCK-8法检测Meg-01细胞增殖活性;采用AlamaBlue试剂盒分析血小板样颗粒活性;通过荧光定量PCR检测GATA-1、Bcl-2、PAR1和PAR4的mRNA水平的表达;通过Western blot检测MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路及PTEN表达水平;巨核细胞分化标志蛋白CD41b的表达采用Western blot和流式细胞术两种方法检测;巨核细胞和血小板标志性糖蛋白CD61的表达、细胞周期变化和细胞凋亡情况采用流式细胞术进行检测;以ADP作为激活剂，在显微镜下观察血小板样颗粒的聚集状态。结果表明:Meg-01细胞的CD61阳性率高达92.4％。凝血酶刺激后Meg-01细胞产生了伪足和血小板样颗粒物。凝血酶可抑制Meg-01细胞的增殖，促进其凋亡，诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。凝血酶上调了控制巨核细胞发育成熟的细胞转录因子GATA-1、凝血酶受体PAR1和PAR4的mRNA表达，下调了凋亡抑制蛋白Bcl-2的mRNA水平。凝血酶促进CD41b表达升高，下调PTEN的表达并上调ERK和AKT磷酸化水平。经凝血酶诱导产生的血小板样颗粒具有活性，并能发生聚集反应。由此可见，凝血酶可能在巨核细胞分化为血小板的过程中发挥一定的作用。
　　FXa和凝血酶同样是凝血系统中关键的凝血因子，Fxa是一种丝氨酸蛋白酶，既然凝血酶可能在巨核细胞分化为血小板的过程中发挥一定的作用，且这种作用可能是通过PARs进行，那么Fxa可能也通过激活PARs对巨核细胞分化产生一定影响。因此，接着探讨了Fxa在成巨核细胞白血病细胞Meg-01细胞分化为血小板样颗粒中的作用及其机制。采用CCK-8法检测Meg-01细胞增殖活性;采用AlamaBlue试剂盒分析血小板样颗粒活性;通过流式细胞术检测细胞周期变化和细胞凋亡情况;周期相关蛋白Skp2的表达和MAPK/ERK和PI3K/AKT信号通路通过Western blot检测;巨核细胞分化标志蛋白CD41b表达采用Western blot和流式细胞术检测。结果表明:Fxa也能促进巨核细胞产生伪足和血小板样颗粒。FXa抑制Meg-01细胞的增殖，促进其凋亡，还可以触发细胞G2/M期阻滞并下调Skp2蛋白表达。Fxa促进CD41b表达并提高ERK和AKT磷酸化水平。Meg-01细胞经Fxa刺激后产生了有活性的血小板样颗粒。由此可见，FXa也可能在巨核细胞分化为血小板的过程中发挥一定的作用。
　　综上所述，凝血酶和FXa都能够改变Meg-01细胞形态，刺激Meg-01细胞产生伪足和血小板样颗粒，抑制Meg-01细胞增殖，促进凋亡。因此二者可能在巨核细胞分化为血小板过程中均有发挥一定的作用。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 巨核细胞的成熟与血小板形成研究进展

1．1．1 巨核细胞的来源

1．1．2 巨核细胞分化过程

1．1．3 血小板生成理论模型

1．1．4 巨核细胞的凋亡与血小板的生成

1．1．5 血小板生成中的调控因子

1．2 Meg-01细胞的研究进展

1．3 凝血因子研究进展

1．4 PARs家族的研究进展

1．5 转录因子GATA-1的研究进展

1．6 Bcl-2家族研究进展

1．7 PI3K／AKT信号通路研究进展

1．8 MAPK／ERK通路研究进展

1．9 PTEN研究进展

1．10 血小板异常与疾病的发生

1．11 本课题研究的目的和意义

1．11．1 研究目的及意义

1．11．2 研究的内容

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 主要细胞株

2．1．3 主要试剂

2．1．4 主要仪器

2．1．5 溶液配制方法

2．2 常用实验方法

2．2．1 细胞复苏

2．2．2 细胞培养

2．2．3 细胞冻存

2．2．4 细胞总蛋白提取

2．2．5 细胞总RNA的提取

2．2．6 免疫蛋白印记

2．2．7 逆转录扩增

2．2．8 荧光定量PCR扩增

2．2．9 蛋白浓度检测

2．2．10 统计学分析

第三章 凝血酶在Meg-01细胞分化为血小板中的作用及其机制

3．1 实验步骤

3．1．1 细胞形态学观察

3．1．2 细胞的活性检测

3．1．3 血小板样颗粒活性检测

3．1．4 流式细胞术测细胞凋亡

3．1．5 流式细胞术测细胞周期

3．1．6 流式细胞术测细胞表面标记CD41b

3．1．7 流式细胞术测巨核细胞表面标记CD61

3．1．8 流式细胞术测血小板颗粒表面标记CD61

3．1．9 荧光实时定量PCR测GATA-1、Bcl-2、PAR1及PAR4 mRNA表达量

3．1．10 免疫蛋白印记法测目的蛋白表达

3．1．11 血小板颗粒聚集实验

3．2 实验结果

3．2．1 Meg-01细胞是巨核细胞系

3．2．2 凝血酶引起Meg-01细胞形态学变化

3．2．3 凝血酶抑制Meg-01细胞增殖

3．2．4 凝血酶对Meg-01细胞周期的影响

3．2．5 凝血酶诱导Meg-01细胞凋亡

3．2．6 凝血酶对GATA-1、Bcl-2、PAR1和PAR4的表达的影响

3．2．7 凝血酶促进CD41b表达

3．2．8 凝血酶激活MAPK／ERK和PI3K／AKT通路

3．2．9 凝血酶促进PTEN的表达

3．2．9 血小板样颗粒的活性检测

3．2．10 血小板样颗粒的CD61表达检测

3．2．11 血小板样颗粒的聚集

3．3 结论与讨论

第四章 凝血因子Xa在Meg-01细胞分化为血小板中的作用及其机制

4．1 实验步骤

4．1．1 细胞形态学观察

4．1．2 细胞活性检测

4．1．3 血小板样颗粒活性检测

4．1．4 细胞周期检测

4．1．5 流式细胞术测细胞表面标记CD41b

4．1．6 免疫印记法检测目的蛋白的表达

4．2 实验结果

4．2．1 凝血因子xa促进Meg-01细胞产生血小板样活性颗粒

4．2．2 凝血因子Xa抑制Meg-01细胞增殖

4．2．3 凝血因子Xa诱导Meg-01细胞凋亡

4．2．4 凝血因子Xa对Meg-01细胞周期的影响

4．2．5 凝血因子Xa促进CD41b表达

4．2．6 凝血因子Xa激活MAPK／ERK和PI3K／AKT通路

4．3 结果与讨论

第五章 结论

参考文献

附录

致谢

攻读学位期间发表的学术论文

声明