南极磷虾共生微生物的筛选及其抗氧化多肽的发酵制备和活性研究

摘要

南极磷虾资源是世界上最大的动物蛋白资源，但长期以来其大部分只是应用于水产养殖等低附加值产业，生物利用率一直较低。近年来，生物活性肽的广泛研究及应用引发了人们从各种蛋白中提取活性肽的热潮。本文以南极磷虾作为研究对象，用从南极磷虾中分离得到的共生菌进行发酵，得到抗氧化活性肽，并以还原力为指标进行发酵条件的优化，在此基础上将抗氧化肽进行初步分离纯化，并对纯化后多肽组分进行氨基酸序列分析，最后研究了南极磷虾多肽体内、体外抗氧化活性的稳定性。
　　首先，从南极磷虾中分离得到具有潜在价值的十株共生菌株，用共生菌株发酵南极磷虾，以羟自由基清除率和还原力为筛选指标，测定发酵液的抗氧化性，结果发现菌株NL-6发酵得到的发酵液的抗氧化活性最高，羟自由基清除率为91.7％，还原力为0.804，通过生理生化特征试验和16S rRNA的序列分析，初步确定了NL-6菌株为嗜冷杆菌属（Psychrobacter）。采用响应面法对NL-6发酵南极磷虾的生产工艺进行优化，得到最佳发酵条件为：培养基比例：6.4g磷虾/50mL自来水，发酵时间：30.4h，发酵温度：36.8℃，得到南极磷虾发酵液的实际相对还原力为0.679（NL-6发酵液还原力与同等质量南极磷虾还原力之差），而同等质量南极磷虾培养基还原力为0.412，因此响应面优化后发酵液实际还原力达到1.091，与预测值差异不显著（p<0.05）。
　　将发酵液离心，利用超滤膜截流，分离成四个组分：AKF-I(MW>10kD), AKF-II(MW:5–10kD), AKF-III(MW:0.5-5kD)和AKF-IV(MW<0.5kD),各组分冻干后测得AKF-III组分抗氧化活性最好，10mg/mL时其羟自由基清除率、还原力、DPPH清除率、ABTS自由基清除率分别为74.1%、0.998、56.2%、89.7%，氟含量（178±3.4mg·kg-1）达到欧盟标准，该组分经半制备型的RP-HPLC分离，纯化后P2组分还原力最大，质量浓度为100μg/mL时为1.214，后通过LC-MS/MS对P2组分做相关抗氧化肽段的氨基酸序列分析。
　　南极磷虾抗氧化肽段AKF-P2的体内外稳定性研究表明：热稳定性较好，高温作用2h后，羟自由基清除率依然保持在89%以上，还原力保持在87%以上；当pH为碱性时，羟自由基清除率与对照组相比略有降低（14%左右），pH为8时，AKF-P2还原力最大，比对照组高12.6%；日光照射下，随着贮藏天数的增加，AKF-P2羟自由基清除活性下降较为明显，第8天时羟自由基清除活性降低了76.3%，因此应避光贮藏；在各金属离子存在下，AKF-P2羟自由基清除率几乎不受影响，而还原力大小受金属离子影响较大，Cu2+离子浓度为5mmol/L时，还原力与对照相比下降了93%；Ca2+对AKF-P2抗氧化性影响最小，因此该含该抗氧化肽的保健食品可与各种补钙产品同服，而其抗氧化活性几乎不受影响。胃肠道消化环境模拟对羟自由基清除率影响较大，经过胃蛋白酶和胰蛋白酶双重消化作用后，羟自由基清除率降低了70%左右，而还原力经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后，活性几乎不变，仅降低了15%左右。

目录

第一章 绪论

1.1南极磷虾资源利用现状

1.2南极磷虾活性物质

1.3 海洋生物抗氧化肽的研究现状及前景

1.4 海洋生物抗氧化肽的综合应用

1.5选题背景及课题研究内容

第二章 南极磷虾共生微生物的筛选与鉴定

2.1 引言

2.2材料

2.3 实验方法

2.4 结果与讨论

2.5 本章小结

第三章 响应面法优化南极磷虾抗氧化肽工艺研究

3.1 引言

3.2 材料

3.3 实验方法

3.4 结果与讨论

3.5 本章小结

第四章 南极磷虾多肽的抗氧化活性及相关多肽序列分析

4.1 前言

4.2 材料

4.3 实验方法

4.4 结果与讨论

4.5 本章小结

第五章 南极磷虾抗氧化肽的稳定性分析

5.1前言

5.2材料

5.3 实验方法

5.4结果与讨论

5.5本章小结

结论与展望

结论

本论文主要创新点

展望

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文

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