Epstein-Barr Virus（EBV）感染与胃癌发生的分子机理研究

摘要

目的：明确胃癌组织中EB病毒(Epstein-Barr Virus，EBV)潜伏期和裂解期基因的表达情况，在分子水平探讨EBV及其编码基因在胃癌发生发展中的作用。 方法:应用PCR-Southern杂交检测185例胃癌组织和相应癌旁组织中特异性EBV DNA，进一步用原位杂交技术检测PCR阳性标本石蜡切片组织中EBV小RNA(EBERl)的表达，以确证EBV相关胃癌(EBV-associated gastric carcinoma.EBVaGC)。应用RT-PCR和Southern杂交检测EBVaGCs组织中EBV启动子(Qp、Wp和Cp)、潜伏期基因(核抗原EBNA1和EBNA2，潜伏膜蛋白LMP1、LMP2A和LMP2B)和裂解期基因(即刻早期基因BZLF1和BRLF1，早期基因BARF1和BHRF1，晚期基因BcLF1和BLLF1)的表达。 结果： ①.185例胃癌组织中有13例为EBVaGCs(7.03％)，相应癌旁组织均为阴性，二者之间EBV检出率的差别有显著性(x2=11.0769，P=0.0009)。统计学分析表明EBVaGCs和EBV阴性胃癌(EBV-negative gastric carcinoma，EBVnGC)在年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位的差异均无显著性，P值分别为0.669，0.141，0.259，0.818，0.064，但性别之间的差异有显著性，男性EBV阳性率高于女性(x2=3.9404，P=0.0471)。 ②.13例EBVaGCs组织中EBV启动子Qp表达阳性而Wp和Cp均为阴性。 ③.潜伏期基因EBNA1表达均为阳性，有5例LMP2A表达阳性，而EBNA2、LMP1和LMP2B mRNA均为阴性。④裂解期基因中即刻早期基因BZLF1有6例表达阳性，而BRLF1 mRNA均为阴性；早期基因中有6例BARF1表达阳性，2例BHRF1表达阳性；晚期基因BcLF1有7例表达阳性，而BLLF1 mRNA均为阴性。 结论 ①.EBV感染与胃癌的发生发展有一定相关性，EBVaGC好发于男性，但EBV感染与胃癌病人年龄、病理类型、临床分期、淋巴结转移和发病部位无明显相关性。 ②.EBVaGC组织中病毒潜伏状态为Ⅰ型潜伏或介于Ⅰ和Ⅱ型潜伏之间的独特类型。 ③.部分EBVaGC组织中可检测到EBV裂解期基因的表达，早期基因BARF1和BHRF1在胃癌发生和发展过程中可能发挥重要作用，但EBV部分裂解期基因发生的机制以及在胃癌发生发展过程中的作用有待进一步研究。

目录

声明

第一部分EB病毒感染与胃癌发生关系的研究

引言

第一章材料与方法

1.1仪器、试剂和耗材

1.2研究对象

1.3核酸提取

1.4 PCR-Southem杂交检测EBV基因组

1.5原位杂交检测EBV EBER1的表达

1.6 EBV核抗原家族基因启动子、潜伏期基因、裂解期基因的RT-PCR检测

1.7实验结果的统计学分析

第二章结果

2.1胃癌组织和相应癌旁组织中EBV基因组及EBER1的检测

2.2 EBV感染与病人临床病理特征的关系

2.3 EBVaGC组织中病毒基因表达的RT-PCR分析结果

第三章讨论

3.1 EBV感染与胃癌的关系

3.2 EBV潜伏期基因的表达

3.3 EBV裂解期基因的表达

附表185例胃癌病人临床资料

参考文献

第二部分：EB病毒对人胃癌细胞系HSC-39感染的研究

引言

第一章材料与方法

1.1仪器、试剂和耗材

1.2细胞

1.3靶细胞的感染

1.4免疫荧光检测

1.5原位杂交检测EBV编码小RNA1(EBER1)

1.6 PCR-Southem检测EBV DNA

1.7 MTT法检测细胞增生

1.8软琼脂培养检测细胞克隆形成率

1.9 Western blotting检测EBV编码蛋白表达

1.10 RT-PCR分析

1.11 HSC-39细胞及感染细胞克隆中CD21的检测

第二章结果

2.1 EBV对HSC-39细胞的感染

2.2 Akata和P3HR-1 EBV感染对HSC-39形态及生长的影响

2.3 Akata和P3HR-1感染细胞中EBV基因的表达

2.4 HSC-39细胞及感染细胞克隆中CD21受体的表达

第三章讨论

参考文献

第三部分LMP1沉默对AP-1信号转导通路的影响

引言

第一章材料与方法

1.1仪器、试剂和耗材

1.2 siRNA的转染

1.3 RNAi效应的检测

1.4半定量RT-PCR检测c-jun,survivin,CDK4和MMP9mRNA转录表达

1.5 Western Blotting检测c-jun,unB和CDK4的表达

1.6免疫组化检测survivin表达

1.7统计学分析

第二章结果

2.1 siRNA作用对LMP1蛋白表达的影响

2.2 Hochest33258染色观察细胞凋亡

2.3透射电镜观察细胞超微结构的变化

2.4 LMP1沉默对c-jun，CDK4,survivin和MMP9mRNA表达的影响

2.5 Western Blotting检测siRNA作用对c-jun,JunB和CDK4蛋白表达的影响水平

2.6细胞免疫组化检测siRNA作用后survivin表达水平

第三章讨论

第四章结论

参考文献

综述EBV与细胞感染关系的研究进展

发表相关论文和成果

致谢