星形胶质细胞在帕金森病神经元铁代谢紊乱中的调节作用研究

摘要

帕金森病(PD)是一种以黑质致密带多巴胺能神经元进行性缺失为特征的中枢神经系统退行性疾病。其临床表现为运动不能、肌僵直、静止性震颤及姿势反射障碍等。尽管研究显示遗传、环境和年龄等因素均可能参与PD发病，但其确切病因不清。目前大量的研究证实，黑质部位氧化应激及铁聚积参与了PD的发病，异常增多的铁通过Fenton反应促进过氧化物的降解产生大量的羟自由基造成细胞的死亡。在PD病人及动物模型的黑质存在铁选择性的沉积，而其他脑区未见铁含量的增加;在PD动物模型中应用铁离子螯合剂可起到明显的神经保护作用;应用MRI可以观察到PD病人早期黑质铁含量就增加，而且铁的水平与PD的进程相关。目前关于PD局部铁沉积的研究主要集中在神经元铁代谢异常。而关于氧化应激状态下，星形胶质细胞对神经元铁沉积影响的研究较少。 占脑体积20％-50％的星形胶质细胞在神经系统的发育、突触传递、离子平衡、神经免疫等方面，都起着十分重要的作用。星形胶质细胞参与血脑屏障的形成，脑内重要的铁转入蛋白二价金属离子转运体1(DMT1)主要表达在星形胶质细胞围绕毛细血管的终足上，提示这类细胞在铁由脑外转运到脑内的过程中发挥重要作用。星形胶质细胞有极强的铁积聚能力，可以通过细胞内铁蛋白(ferritin)储存铁，并通过铁转出蛋白ferroportin1(FPN1)将铁转运回血液。铁负载时，神经元和小胶质细胞死亡，而星形胶质细胞却在同样的情况下增生。由此可见，星形胶质细胞在脑内铁稳态的调节、保护脑内其它细胞免受铁介导的氧化应激损伤中必然发挥重要的调节作用。本研究应用原代培养的星形胶质细胞及胚胎培养腹侧中脑(VM)神经元为细胞模型，应用激光共聚焦显微镜观察、小干涉RNA、免疫印迹、免疫荧光双重标记技术、荧光实时定量PCR等方法，深入讨论神经毒素6-羟基多巴胺（6-OHDA）处理后原代培养星形胶质细胞自身铁代谢改变，及其合成分泌的神经营养因子脑源性神经营养因子(BDNF)、胶质源性神经营养因子(GDNF)对VM神经元铁代谢的影响，并进一步探讨相关作用机制。结果如下: 1.10μM、100μM6-OHDA处理24 h后，原代培养星形胶质细胞经荧光染料钙黄绿素孵育并给予1 mM Fe2SO4灌注，随灌流时间延长细胞内荧光较对照组出现明显的衰减，且100μM组减弱较10μM组明显。再给予铁离子螯合剂1 mMDFO灌注后，10μM、100μM6-OHDA处理组细胞内荧光增强均较对照组明显。说明6-OHDA处理后星形胶质细胞铁转运效率增加。 2.原代培养星形胶质细胞在10μM、100μM6-OHDA处理24 h后，DMT1+IRE蛋白表达升高，分别约为对照组的1.51倍及1.95倍，且10μM组与100μM组相比差别有统计学意义。铁转出蛋白FPN1蛋白表达也较对照组升高，升高幅度分别为40％、29％。免疫荧光双重标记技术检测到6-OHDA处理24 h后星形胶质细胞内DMT1+IRE表达增强，呈颗粒状分布于胞核、胞浆;FPN1表达同样增强，主要分布在胞体及突起。与蛋白水平的变化一致，10μM、100μM6-OHDA处理24 h后，星形胶质细胞中DMT1+IRE mRNA的表达升高，分别约为对照组的1.9倍及3倍，且10μM组与100μM组相比差别有统计学意义。FPN1 mRNA的表达同样升高，分别约为对照组的1.8倍及2.7倍，且10μM组与100μM组间差别有统计学意义。 3.铁调节蛋白1(iron regulatory protein1，IRP1)蛋白表达随6-OHDA处理时间呈动态改变，6-OHDA处理12h可见IRP1表达显著升高，10μM，100μM6-OHDA组分别为对照组的1.52及1.31倍。然而随6-OHDA作用时间延长，24 h IRP1表达反而低于正常水平，分别为对照组的69％、79％。但10μM组与100μM组两组间没有显著性差异。 4.10μM、100μM6-OHDA处理0.5 h后，星形胶质细胞内核因子κB(nuclearfactorκB，NFκB)p65亚基磷酸化增强，并出现明显的核移位。IκB抑制剂BAY11-7082（5μM）预处理0.5 h可有效抑制6-OHDA诱导的NFκB p65亚基磷酸化。6-OHDA处理24 h仍可见细胞核内磷酸化NFκB p65表达较对照组升高。5μM BAY11-7082预处理0.5 h后与10μM、100μM6-OHDA共同孵育24h，可阻断6-OHDA诱导的星形胶质细胞内DMT1+IRE蛋白表达升高，提示6-OHDA诱导的DMT1上调与NFκ p65磷酸化有关。 5.10μM、100μM6-OHDA处理后6h，星形胶质细胞内BDNF、GDNF mRNA的表达迅速到达高峰，其中10μM6-OHDA处理组BDNF mRNA在6h时为对照组的3.4倍，100μM组为对照组的2.4倍;12h时分别为对照组的1.9倍及1.6倍，24 h与对照组差异无显著性。GDNF mRNA在6-OHDA处理6h时10μM组为对照组的3.3倍，100μM组为对照组的5.1倍;12h时分别为对照组的1.5倍及1.9倍，24 h分别为对照组的1.8倍、2.1倍。这些结果提示，在6-OHDA诱导的氧化应激状态下星形胶质细胞内BDNF、GDNF水平增加。 6.10μM6-OHDA处理原代培养VM神经元24h后细胞摄铁能力增强，10ng/ml BDNF/GDNF预处理4h后与6-OHDA共同孵育可以阻断6-OHDA引起的VM神经元摄铁增加。 7.10μM6-OHDA处理组VM神经元24h后DMT1+IRE蛋白表达水平明显高于对照组，约为对照组的1.5倍;10 ng/ml BDNF/GDNF单独处理原代培养VM神经元24 h后，DMT1+IRE蛋白较对照组降低26％、21％;且BDNF/GDNF预处理可完全抑制6-OHDA诱导DMT1+IRE的蛋白表达的上调。与蛋白表达变化一致，6-OHDA可以上调DMT1+IRE的mRNA表达水平，BDNF/GDNF均可以下调DMT1+IRE mRNA水平的表达，分别为对照组的50％、60％;且BDNF/GDNF预处理可完全抑制6-OHDA诱导DMT1+IRE的mRNA表达的上调。 8.10ng/mlBDNF/GDNF处理VM神经元24 h后，细胞内IRP1的表达降低，分别较对照组下降19％、17％;10μM6-OHDA处理原代培养VM神经元24 h引起IRP1表达升高;BDNF/GDNF与10μM6-OHDA共同孵育，可以阻断6-OHDA引起的IRP1上调。应用siRNA技术降低多巴胺能神经元细胞系MES23.5细胞内IRP1的表达后，BDNF、GDNF诱导的IRP1下调被完全阻断。9.10 ng/ml BDNF/GDNF均可动态激活MEK/ERK1/2及IP3K/Akt信号通路，ERK1/2和Akt磷酸化水平均在0.5 h达到高峰。BDNF对ERK1/2及Akt的激活效应至少持续4h。GDNF孵育1h后磷酸化ERK1/2水平与对照组没有明显差异。GDNF对Akt激活效应至4h恢复正常水平。MEK特异性抑制剂PD98059(5μM)、PI3K特异性抑制剂LY294002(2.5μM)处理0.5 h后给予BDNF/GDNF共同孵育0.5 h，可完全阻断BDNF/GDNF诱导的ERK1/2和Akt磷酸化。 10.PD98059（5μM）或LY294002（2.5μM）预处理0.5 h后与BDNF/GDNF(10 ng/ml)共同孵育24 h，可以完全阻断BDNF/GDNF诱导的VM神经元IRP1下调，并进一步完全阻断BDNF/GDNF诱导的DMT1+IRE蛋白表达下调。PD98059甚至在mRNA水平逆转BDNF/GDNF引起的DMT1+IRE的下调。 综上所述，在6-OHDA诱导的氧化应激状态下星形胶质细胞铁转运能力增强，防止自身铁沉积，并可能参与脑内铁稳态调节。其铁转运功能的改变与铁转入蛋白DMT1+IRE和铁转出蛋白FPN1的表达上调一致。细胞内IRP1表达变化及NFκB p65的核移位可能从转录后及转录水平调节细胞内铁转运相关蛋白DMT1+IRE、FPN1的表达。同时星形胶质细胞合成神经营养因子BDNF/GDNF增加，这些神经营养因子可能通过激活原代培养VM神经元内MEK/ERK1/2、PI3K/Akt通路下调神经元内IRP1表达，并转录后调节DMT1+IRE的表达，从而减弱铁转入过程，减轻6-OHDA导致的铁积聚，可能与其神经保护作用相关。本研究将为深入研究星形胶质细胞功能及对氧化应激状态下神经元内铁代谢调节提供新的理论和实验依据。

目录

摘要

引言

材料与方法

1．星形胶质细胞、腹侧中脑(ventral mesencephalic，VM)神经元原代培养

2．免疫组织化学方法鉴定原代培养星形胶质细胞、VM神经元纯度

3．MES23．5多巴胺能细胞系的培养及IRP1小干涉RNA(small interfering RNA，siRNA)质粒转染

4．钙黄绿素负载检测原代培养星形胶质细胞、VM神经元铁转入、转出功能

5．免疫印迹检测原代培养星形胶质细胞、VM神经元DMT1+IRE、FPN1、IRP1、磷酸化NFκB p65、磷酸化ERK1／2及磷酸化Akt蛋白表达

6．荧光实时定量PCR检测原代培养星形胶质细胞、VM神经元DMT1+IRE、FPN1、BDNF、GDNF mRNA表达

7．免疫荧光双重标记技术检测原代培养星形胶质细胞内DMT1+IRE、FPN1、phospho-NFκB p65表达及VM神经元内MAP2、phospho-ERK、phospho-Akt表达

8．数据处理及统计学分析

结果

1．6-OHDA处理提高星形胶质细胞铁转运能力

2．6-OHDA上调原代培养星形胶质细胞中DMT1+IRE、FPN1的表达水平

3．IRP1、NFκB参与6-OHDA对原代培养星形胶质细胞内DMT1+IRE、FPN1的表达调控

4．6-OHDA处理诱导原代培养星形胶质细胞BDNF、GDNF mRNA表达动态改变

5．BDNF／GDNF处理减少原代培养VM神经元铁摄取

6．BDNF／GDNF下调原代培养VM神经元DMT1+IRE、IRP1的表达水平

7．MEK／ERK、PI3K／Akt通路参与BDNF／GDNF对IRP1、DMT1+IRE的表达调控

讨论

结论

参考文献

综述 星形胶质细胞生理及病理生理功能

发表和待发表论文

参加的国际国内会议

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致谢

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