迷迭香酸对铁处理的SK-N-SH细胞的神经保护作用机制研究

摘要

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是中老年人常见的神经系统退行性疾病。其主要临床特征是静止性震颤，肌僵直，姿势反射障碍等。PD的主要病理学改变为黑质(substantia nigra，SN)多巴胺（dopamine，DA）神经元变性缺失，以及alpha-突触核蛋白聚集的路易小体的形成。迄今为止，PD的病因及发病机制仍不清楚。近年来，越来越多的研究发现PD病人黑质中铁含量增加，铁的异常增高和铁诱发的氧化应激反应可能是PD发病中的关键因素。而alpha-突触核蛋白是PD特征性病理标志Lewy小体的主要成分，其聚集及由此引起的黑质多巴胺能神经元变性死亡是PD的主要病理改变。前期研究证实铁可诱导alpha-突触核蛋白的表达及聚集，alpha-突触核蛋白的聚集可加重铁对神经元的损伤，提示铁在alpha-突触核蛋白聚集中发挥着重要的作用。
　　迷迭香酸(rosmarinic acid，RA)是一种天然抗氧化剂，它由一分子咖啡酸和一分子丹参素组成，为水溶性多酚类化合物。RA具有抗炎，抗菌，抗病毒，免疫抑制等多种生物活性。我们前期研究证实迷迭香酸对神经毒素6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)及1-甲基-4-苯基吡啶阳离子（1-methyl-4-phenylpyridinium ion，Mpp+）诱导的细胞损伤具有保护作用，其机制可能与抗氧化应激、抗凋亡、降低黑质铁水平有关。但是其保护作用的分子机制仍不清楚。已经证实迷迭香酸在体外可以通过抗氧化作用来抑制alpha-突触核蛋白纤维的生成，还可以降解已形成的alpha-突触核蛋白纤维。但是迷迭香酸是否可以通过抑制alpha-突触核蛋白的聚集在PD中发挥其保护作用尚不清楚，其对alpha-突触核蛋白的生成及聚集的调节机制也未见报道。因此，本实验在多巴胺能神经细胞SK-N-SH细胞上，应用流式细胞术(flow cytometry, FCM)检测线粒体膜电位的改变，免疫组织化学检测alpha-突触核蛋白的聚集、实时荧光定量PCR及western blots检测HO-1，alpha-突触核蛋白，IRP1的表达，以期阐明RA对铁诱导的alpha-突触核蛋白聚集的影响及其可能的机制。实验结果如下:
　　1.100μmol/L Fe2+和100μmol/L FAC处理SK-N-SH细胞24 h后，细胞线粒体跨膜电位差（mitochondrial transmembrane potential，△Ψm）明显降低(P＜0.05)。RA预处理可以阻断上述改变(P＜0.05)。
　　2.1 mmol/L Fe2+和FAC分别处理SK-N-SH细胞24 h，细胞内alpha-突触核蛋白的聚集较对照组明显增多。而10-3和10-4 mol/L RA预处理可以拮抗铁诱导的alpha-突触核蛋白的聚集。
　　3.FAC（100μmol/L）和RA(10-4 mol/L)单独处理SK-N-SH细胞均可以上调HO-1mRNA及蛋白水平，与对照组相比，差别有统计学意义（P＜0.05）;而FAC/RA共孵育，可以使HO-1 mRNA及蛋白水平较FAC处理组进一步增加（P＜0.05）。
　　4.FAC（100μmol/L）处理SK-N-SH细胞24 h，alpha-突触核蛋白mRNA的表达明显增加，与对照组相比，差别有统计学意义（P＜0.05）。RA预处理后能够显著的抑制FAC诱导的alpha-突触核蛋白mRNA的表达增加（P＜0.05）。
　　5.FAC（100μmol/L）处理SK-N-SH细胞24 h，IRP1的蛋白水平下降，与对照组相比，差别有统计学意义(P＜0.05)。而FAC/RA共孵育，可以使IRP1蛋白水平较FAC处理组明显上升，差别有统计学意义(P＜0.05)。
　　上述实验结果表明:高铁可以引起细胞△Ψm的降低，促进alpha-突触核蛋白的聚集，并通过IRE/IRP机制，升高铁诱导的alpha-突触核蛋白mRNA的表达，引起SK-N-SH细胞的损伤。而RA预处理SK-N-SH细胞，在一定浓度下可以部分逆转细胞内高铁造成的△Ψm降低，使HO-1的mRNA及蛋白上升，从而抑制铁诱导的alpha-突触核蛋白的聚集，并通过IRE/IRP机制，降低铁诱导的alpha-突触核蛋白mRNA的表达，从而减轻高铁水平对细胞造成的损害。本实验所研究的RA对DA能神经元的保护作用以及对其可能机制的初步探讨，为PD的防治提供全新的研究结果和药物防治的新策略。