人参皂甙Rg1及染料木素对SK-N-SH神经细胞保护作用的机制研究

摘要

植物雌激素是一类天然产品，具有类雌激素样作用，可清除自由基和抗氧化。人参皂甙Rg1是人参的主要活性成分，染料木素(Genistein)是大豆异黄酮的主要活性成分，二者均为已知的植物雌激素。研究显示Rg1和染料木素具有神经保护作用，但其详细作用机制目前尚不清楚。本研究应用6-羟基多巴(6-hydroxydopamine，6-OHDA)诱导多巴胺能神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH细胞损伤，采用MTT、流式细胞仪、激光共聚焦、RT-PCR、免疫印迹及荧光素酶活性检测等多种评价方法，观察Rg1和染料木素对SK-N-SH神经细胞的保护作用及胰岛素样生长因子Ⅰ受体(Insulin-like Growth Factor-I Receptor，IGF-IR)阻断剂JB-1或雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)阻断剂ICI182,780的阻断效应。实验结果如下： 1.6-OHDA可剂量依赖式的损伤SK-N-SH细胞(P<0.01)，Rg1和染料木素可对抗6-OHDA的毒性作用(P<0.05)。 2.6-OHDA可将细胞停留在G0G1期，抑制细胞进入S期。Rg1和染料木素可促进细胞从G0G1期进入S期，此作用可以被JB-1或ICI182,780所阻断(P<0.01)。 3.6-OHDA可明显升高Bax/Bcl-2的基因表达(P<0.01)，Rg1和染料木素则可明显降低Bax/Bcl-2之比值。 4.6-OHDA可明显升高Bax的蛋白表达(P<0.01)，降低Bcl-2的蛋白表达(P<0.05)，Rg1和染料木素则可明显逆转上述改变。 5.Rg1和染料木素可部分拮抗6-OHDA对SK-N-SH细胞线粒体膜电位的降低作用(P<0.01)，此作用可以被JB-1或ICI182,780所阻断(P<0.01)。 6.Rg1和染料木素可明显升高雌激素反应元件(Estrogen Responsive Elements，ERE)及IGF-IR启动子的荧光活性(P<0.01)。 以上结果表明人参皂甙Rg1及染料木素可明显对抗6-OHDA对SK-N-SH神经细胞的损伤，其机制可能与IGF-IR途径与ER途径的激活及抗凋亡有关。本研究不仅为Rg1及染料木素的神经保护作用提供了进一步的实验依据，而且为传统中药的新用途和进一步开发为可用于临床防治帕金森病的新药提供实验依据。

目录

文摘

英文文摘

声明

引言

第一章实验材料

1.1 SK-N-SH细胞

1.2实验试剂

1.3实验仪器

第二章实验方法

2.1 SK-N-SH细胞培养

2.2活性炭/葡聚糖处理的胎牛血清（Charcoal-stripped Fetal Bovine Serum,sFBS）的制备

2.3 MTT法检测细胞活力

2.3.1 MTT法实验原理

2.3.2细胞计数

2.3.3 MTT法测定

2.4 半定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测BCL-2和Bax基因表达

2.4.1总RNA的提取

2.4.2引物设计

2.4.3逆转录反应（cDNA的合成）

2.4.4 PCR反应

2.4.5 PCR产物定量分析

2.5流式细胞仪检测细胞周期的变化

2.5.1样本准备

2.5.2样本检测

2.6激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位的变化

2.6.1原理

2.6.2样本准备

2.6.3拍摄图像及数据统计

2.7免疫印迹实验

2.7.1原理

2.7.2蛋白提取

2.7.3应用Bradford试剂检测蛋白浓度

2.7.4聚丙烯酰胺凝胶电泳

2.7.5湿式电泳转移

2.7.6免疫印迹

2.8荧光素酶活性测定

2.8.1原理

2.8.2瞬时转染SK-N-SH细胞

2.8.3荧光素酶活性检测

2.9统计学分析

第三章实验结果

3.1人参皂甙Rg1对SK-N-SH神经细胞保护作用的机制研究

3.1.1不同浓度的6-OHDA对SK-N-SH细胞的毒性作用及Rg1的保护作用

3.1.2 Rg1预处理对6-OHDA诱导的细胞周期变化的影响及JB-1和ICI182,780的阻断效应

3.1.3 Rg1预处理对6-OHDA诱导的Bcl-2及Bax基因表达的影响

3.1.4 Rg1预处理对6-OHDA诱导的Bcl-2及Bax蛋白表达的影响

3.1.5 Rg1预处理对6-OHDA诱导线粒体膜电位的影响

3.1.6人参皂甙Rg1对ERE及IGF-IR启动子活性的影响

3.2染料木素对SK-N-SH神经细胞保护作用的机制研究

3.2.1染料木素（Genistein）对SK-N-SH神经细胞保护作用

3.2.2染料木素预处理对6-OHDA诱导的细胞周期变化的影响及JB-1和ICI182,780的阻断效应

3.2.3染料木素预处理对6-OHDA诱导的Bcl-2及Bax基因表达的影响

3.2.4染料木素预处理对6-OHDA诱导的Bcl-2及Bax蛋白表达的影响

3.2.5染料木素预处理对6-OHDA诱导线粒体膜电位的影响

3.2.6染料木素对ERE及IGF-IR启动子活性的影响

第四章讨论

结论

参考文献

附图1

附图2

综述：植物雌激素神经保护作用机制研究进展

附录

攻读学位期间发表的论文、参加的会议和参与的课题情况

致谢