stathmin-1与相关蛋白对宫颈上皮内瘤变复发的影响及在宫颈癌细胞中作用机制的研究

摘要

宫颈癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，在发展中国家其新发病例及死亡率较高，严重威胁女性的健康和生命。高级别子宫颈上皮内瘤变是宫颈癌的癌前病变，及时发现和正确有效治疗可以预防疾病进展为宫颈癌，其治疗的预后直接影响宫颈癌的发生。因此，阐明影响宫颈上皮内瘤变预后的因素及找到预防宫颈癌有效的治疗方法非常重要。
　　既往有较多研究证明stathmin-1在多种恶性肿瘤中的表达呈高水平，且与恶性肿瘤的进展及预后相关。但有关stathmin-1在高级别宫颈上皮内瘤变中的表达与相关分子蛋白的相互关系及对疾病的复发及预后的影响研究很少。
　　本课题通过研究stathmin-1、P27、P53、P16、ki-67在高级别宫颈上皮内瘤变中的表达，结合患者HPV感染的状况及术后的预后及复发，探讨stathmin-1对宫颈上皮内瘤变预后的影响及与相关分子蛋白表达的相互作用，探讨stathmin-1与高危HPV感染持续存在的关系。并利用慢病毒载体进行宫颈癌细胞中stathmin-1基因沉默，进一步探讨其影响宫颈疾病发生发展及预后的作用机制。研究共分为四部分。
　　一、Stathmin-1和P53蛋白在高级别宫颈上皮内瘤变中的表达与疾病复发关系及Hela细胞内stathmin-1影响P53蛋白表达的机制研究。
　　目的：为了解stathmin-1与P53蛋白对宫颈上皮内瘤变预后的影响，检测Stathmin-1和P53蛋白在高级别宫颈上皮内瘤变(CIN)中的表达，探讨其对宫颈上皮内瘤变锥切术后复发的影响及机制；并研究stathmin-1表达在宫颈癌Hela细胞内影响P53蛋白表达的机制及对细胞增殖的影响。
　　方法：收集2010年1月1日-2013年1月30日因高级别宫颈上皮内瘤变行宫颈冷刀锥切，术后复发病例30例为复发组，随机抽取同期因同疾病行宫颈锥切术随访2年无复发病例30例为对照组，调取两组患者首次锥切的组织蜡块，利用免疫荧光及免疫组化法对两组组织中Stathmin-1和P53蛋白表达进行检测。构建Stathmin-1siRNA慢病毒载体，包装重组慢病毒，感染宫颈癌hela细胞株，沉默Stathmin-1表达，为干扰组，采用导入阴性片段的慢病毒感染Hela细胞作为对照组。MTT（噻唑蓝）法检测细胞增殖差异，蛋白印迹法（western-blot）检测细胞P53蛋白的表达。
　　结果：复发组P53蛋白阳性表达率为70.0％，明显高于对照组（36.7%），复发组stathmin-1阳性表达率83.3%，明显高于对照组（33.3%），差异有统计学意义(P<0.05)；复发组Stathmin-1与P53蛋白均阳性率70.0%，明显高于对照组（26.7%），差异有统计学意义(P<0.05)。感染重组慢病毒及阴性对照病毒后，Stathmin-1基因干扰组hela细胞增殖24h后较对照组抑制明显，差异有统计学意义（P<0.05），干扰组中P53蛋白与对照组相比，表达明显减少，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：Stathmin-1与P53蛋白过表达可能与高级别宫颈上皮内瘤变术后复发有关，宫颈癌Hela细胞中stathmin-1影响P53蛋白表达，沉默Stathmin-1，可抑制细胞增殖，并抑制细胞内P53蛋白表达。
　　二、Stathmin-1在高级别宫颈上皮内瘤变中与P27、P16及ki-67表达的相互关系及意义。
　　目的：研究stathmin-1与P27、P16及ki-67在高级别宫颈上皮内瘤变中表达的相互关系及对疾病的预后的影响。
　　方法：对2010年1月至2013年6月因宫颈上皮内瘤变Ⅱ-Ⅲ级行宫颈锥形切除患者进行随访，将病理证实复发病例36例设为复发组，随机抽取未复发病例40例作为对照组。采用免疫组化法检测两组病例首次宫颈锥切组织中stathmin-1、P27、P16及ki-67的表达。
　　结果：Stathmin-1复发组30例(83.3%)阳性，对照组16例（40%）阳性，差异有统计学意义（P<0.05）。P27复发组27例（75%）阳性，且表达于胞浆，对照组19例（47.5%）阳性，多表达于胞浆，差异有统计性（P<0.05）。P16与stathmin-1均阳性表达46例，均阴性表达23例，pearson相关系数r为0.63（P<0.001）；ki-67与stathmin-1均阳性表达42例，均阴性表达13例，pearson相关系数r为0.38（P<0.05）。
　　结论：stathmin-1与P27高阳性表达可能与高级别宫颈上皮内瘤变复发有关，stathmin-1高阳性表达与P16、Ki-67的高阳性表达有一定的相关性，可能是stathmin-1影响高级别CIN预后的机制之一。
　　三、宫颈上皮内瘤变术后人乳头瘤病毒持续感染与Stathmin-1表达相关性及临床意义。
　　目的：检测宫颈上皮内瘤变（CIN）中stathmin-1的表达及人乳头瘤病毒（HPV）感染，探讨stathmin-1与锥切术后HPV持续感染的相关性及临床意义。
　　方法：收集2009年1月至2013年1月因CIN2-CIN3行宫颈锥形切除后病例，将其中36例复发病例设为复发组，随机抽取70例未复发病例设为对照组。免疫组化法检测两组病例锥切组织stathmin-1的表达，HPV-DNA法检测高危HPV感染，并分析两组病例术后HPV感染持续情况及与复发的关系。
　　结果：复发组中32例（88.9%）stathmin-1阳性；30例（83.8%）合并HPV持续感染，其中28例stathmin-1阳性表达。对照组中24例（34.2%）stathmin-1阳性表达；16例（22.9%）合并HPV持续感染，其中14例stathmin-1阳性表达。Stathmin-1阳性表达与HPV持续感染有相关性（P<0.001）。复发组与对照组相比stathmin-1阳性表达率及HPV持续感染率差异均有统计学意义（P<0.001）。
　　结论：stathmin-1高阳性表达与宫颈锥切术后患者HPV持续感染有相关性，可能影响高级别CIN预后，为防治高级别CIN复发提供新的思路和理论依据。
　　四、Stathmin-1对chk1表达及对宫颈癌细胞运动和侵袭力的影响研究。
　　目的：研究stathmin-1与chk1在宫颈癌细胞中的相互作用机制，宫颈癌细胞中stathmin-1表达对宫颈癌细胞运动及侵袭力的影响，探讨其在宫颈癌疾病进展中的作用及机制。
　　方法：收集40例宫颈癌原发病灶标本，根据术后病理有无淋巴结转移分为宫颈癌非淋巴结转移组（24例）及淋巴结转移组（16例），采用免疫组化法及实时荧光定量PCR法检测两组标本stathmin-1表达。构建Stathmin-1siRNA慢病毒载体，包装重组慢病毒，感染宫颈癌hela细胞株及C33A细胞株，在宫颈癌细胞中沉默Stathmin-1表达，采用实时荧光定量PCR及western blot法检测感染癌细胞中chk1表达，采用转入阴性片段的慢病毒感染Hela细胞及C33A细胞作为对照。细胞Transwell小室法检测其对宫颈癌细胞运动和侵袭能力的影响。
　　结果：stathmin-1mRNA在淋巴结转移组表达明显高于对照组（P<0.001）；宫颈癌细胞中沉默stathmin-1表达使Chk1表达较对照组细胞明显减少（P<0.01）；沉默stathmin-1的Hela细胞和C33A细胞增殖较对照组细胞在24小时后明显减慢（P<0.05），实验组细胞的运动、侵袭力也较对照组细胞明显降低（P<0.05）。
　　结论：stathmin-1过表达可影响宫颈癌细胞增殖力、运动力和侵袭力，可能是宫颈癌远处转移的因素之一，stathmin-1表达降低可以降低chk1表达，提示两者可能相互作用，干扰宫颈癌细胞周期调控。

目录

前言

第1章 Stathmin-1和P53蛋白在高级别宫颈上皮内瘤变中的表达与疾病复发关系及Hela细胞内stathmin-1影响P53蛋白表达的机制研究

引言

一.材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第2章 Stathmin-1在高级别宫颈上皮内瘤变中与P27、P16及ki-67表达的相互关系及意义

引言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第3章 宫颈上皮内瘤变术后人乳头瘤病毒持续感染与Stathmin-1表达相关性及临床意义

引言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

第4章 Stathmin-1影响chk1表达及对宫颈癌细胞运动和侵袭力的影响研究

引言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

小结

参考文献

综述：宫颈上皮内瘤变及宫颈癌预后的影响因素研究进展

攻读学位期间科研成果

致谢

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