细胞外分泌蛋白CTHRC1在HPV16/18阳性的宫颈组织中的表达和宫颈癌细胞中的作用机制研究

摘要

目的：宫颈癌是世界范围内最常见的癌症之一，其发病机制尚不十分清楚。细胞外分泌蛋白作为肿瘤微环境重要成分之一在肿瘤中的重要性越来越得到重视。本研究通过临床筛查分析了研究人群的高危型HPV分布的特点，通过全基因组基因芯片分析HPV16/18阳性宫颈癌细胞中显著受E6/E7的转录调控的微环境相关的细胞外分泌蛋白，其中分泌蛋白CTHRC1引起了我们的关注。本研究旨在分析CTHRC1在HPV16/18阳性的宫颈组织的表达和宫颈癌细胞中的功能以探讨CTHRC1在HPV16/18阳性宫颈癌发生发展中的分子机制，以期CTHRC1成为一个新的宫颈癌诊断和预后评估的生物标志物以及宫颈癌治疗的新靶点。
　　方法：(1)对1万名妇女进行宫颈HPV分型检测，确定受检人群高危型HPV分布的特点及高危因素，分析研究人群中宫颈癌及癌前病变患者的高危型HPV分布特点。(2)利用RNA干扰技术，基因芯片技术及生物信息学分析技术分析宫颈癌细胞中显著受HPV16/18 E6/E7调控的细胞外分泌蛋白，并进一步在宫颈癌数据库网络中进行验证。(3)用RT-PCR法比较HPV16/18阳性的宫颈组织和HPV阴性的宫颈组织之间，HPV16/18阳性的宫颈炎，CIN和宫颈癌组织之间CTHRC1的表达差异;用免疫组化法分析CTHRC1在宫颈癌，CIN和正常对照的差异，分析CTHRC1的表达与宫颈鳞癌临床病理特征之间的关系。(4)构建过表达和稳转干扰慢病毒载体和纯化的CTHRC1蛋白，分别检测其对HPV16/18阳性的宫颈癌细胞的增殖，侵袭，迁移和化疗抵抗的影响，利用CTHRC1单克隆抗体检测其对纯化蛋白处理宫颈癌细胞的迁移功能影响。(5)构建荧光素酶基因报告系统，检测CTHRC1对宫颈癌Wnt经典通路和非经典通路的影响，并利用磷酸化信号通路芯片检测CTHRC1对Wnt经典通路和非经典通路下游基因的影响。(6)用ELISA法检测CTHRC1在HPV16/18阳性的宫颈癌和癌前病变患者血清中的浓度，分析血清CTHRC1浓度评估宫颈癌的临床诊断价值。
　　结果：(1)1万名妇女中宫颈高危型HPV分布由高到低依次为HPV52、16、58、18和33，其中CIN及宫颈癌患者的HPV类型也主要是HPV16，52和18。(2)HPV16/18阳性的宫颈癌细胞中显著受E6/E7的转录调控的微环境相关的细胞外分泌蛋白前五位依次是GTF2I，INSL6，BIRC3，PTN，CTHRC1，其中CTHRC1与多种肿瘤的发展相关，我们进一步验证了其与宫颈癌的相关性，确定其为研究的目的基因。(3)免疫组化染色的结果显示，CTHRC1在宫颈鳞癌和宫颈腺癌组织中的高表达率分别为50.49％和68.96％，明显高于正常组织（鳞状上皮3.33％，腺上皮6.67％）及CIN组织21.0％的高表达率(P＜0.0001，P＜0.0001，0.0181);
　　在宫颈鳞癌组织中，CTHRC1的表达与肿瘤的临床分期(p=0.0021)、肿瘤细胞的级别(p=0.0186)，淋巴结转移(p=0.0075)，淋巴脉管浸润(p=0.0010)，肿瘤的直径(P＜0.0001)和宫颈基质的浸润深度(p=0.0001)均显著相关，随着临床分期的增加，肿瘤级别的升高，有淋巴结转移和淋巴脉管的浸润，肿瘤直径＞4cm和宫颈基质浸润深度＞1/2者，CTHRC1的高表达率显著增加。(4)划痕实验显示，与对照组比较，CTHRC1过表达细胞(HeLa和SiHa)及CTHRC1蛋白直接处理细胞均能明显促进细胞迁移，CTHRC1稳转干扰细胞均能明显抑制细胞迁移，差异均有显著性（p值均＜0.01）。空穿和胶穿实验显示，CTHRC1过表达细胞穿出transwell小室细胞数明显多于对照组，差异有显著性(p值均＜0.001)，CTHRC1稳转干扰细胞穿出transwell小室数明显少于对照组，差异有显著性（p值均＜0.001）。空穿实验还显示，CTHRC1蛋白处理后细胞穿出transwell小室细胞数明显多于对照组，差异有显著性（p值均＜0.001）。(5)抗CTHRC1单克隆抗体预处理SiHa细胞2min后，20nMCTHRC1重组蛋白再处理SiHa细胞并行空穿实验，结果显示穿出transwell小室的细胞数明显减少(p＜0.001)，提示抗CTHRC1单克隆抗体能够逆转CTHRC1重组蛋白对宫颈癌细胞迁移的促进作用。(6) MTT实验显示，与对照组比较，CTHRC1过表达HeLa细胞和稳转干扰MS751对顺铂和紫杉醇的IC50值和细胞生存活力均无明显影响，差异均无统计学意义(p值均＞0.05); CCK8细胞增殖实验显示，与对照组比较，CTHRC1过表达细胞(HeLa和SiHa)及CTHRC1稳转干扰细胞的增殖活性虽有变化，但均无显著性差异（p值均＞0.05）;裸鼠移植瘤实验显示，过表达CTHRC1 HeLa组肿瘤平均体积及肿瘤重量大小分别为0.634±0.327(g)，0.340±0.21(cm3)，对照组肿瘤平均体积及肿瘤重量大小分别为0.226士0.160(g)，0.13±0.08(cm3)，两组瘤体大小及重量相比较均有统计学意义，P值分别为0.044和0.028。(7)在Wnt经典通路报告系统中，与对照组比较，10nM，20nM CTHRC1蛋白处理Hela细胞组的TOP活性明显降低，差异有显著性（P值分别为0.023和0.0057），10nM，20nM蛋白处理SiHa细胞组TOP活性也明显降低，差异有显著性（P值分别为0.035和0.0068）;在Wnt非经典通路报告系统中，与对照组比较，10nM，20nMCTHRC1蛋白处理Hela细胞组的ATF2活性明显升高，差异有显著性（P值分别为0.0083和0.0062），10nM，20nM蛋白处理SiHa细胞组ATF2活性明显升高，差异有显著性（P值分别为0.0095和0.0056）。CTHRC1蛋白处理SiHa细胞，与对照组比较，30，120和720min时JNK磷酸化表达量均增加，GSK3α/β磷酸化均减少，差异均有显著性（p值均＜0.05）。(8)不同人群的血清CTHRC1经 ELISA检测发现健康人群组的血清CTHRC1平均浓度为3.21±1.70ng/ml(1.42到7.31 ng/ml)，CIN组的CTHRC1平均浓度为4.70±3.12ng/ml(1.26到14.15ng/ml)，宫颈癌患者的CTHRC1平均浓度为7.32±3.51 ng/ml(2.97-16.44ng/ml)。健康人及CIN组与宫颈癌组比较，P值分别为p＜0.0001和0.00053，差异具有显著性。10对宫颈癌患者术前术后血清进行检测，结果显示:宫颈癌患者术前血清CTHRC1平均浓度为10.36±2.70ng/ml这些宫颈癌患者术后血清CTHRC1平均浓度为4.21士1.78，两组数据比较P值为P＜0.0001，有显著的统计学意义;根据血清CTHRC1浓度绘制ROC曲线，结果显示CTHRC1诊断宫颈癌的AUC为0.890±0.048，参考约登指数法(Youden's index)确定诊断临界值为4.20ng/ml，此时CTHRC1诊断高危GIST的灵敏度为84％，特异度为80％。
　　结论：(1)宫颈高危型HPV16和18型阳性的人群是本地区管理和研究的重点。(2) CTHRC1是宫颈癌微环境中受HPVE6/E7调控的重要细胞外分泌蛋白。(3) CTHRC1与HPV16/18阳性宫颈鳞癌的不良预后因素（临床分期，淋巴结转移，脉管浸润，肿瘤级别，宫颈基质浸润深度和肿瘤大小）密切相关，是较好的评估宫颈癌预后和预测复发的生物标志物。(4) CTHRC1在宫颈癌中能促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。(5)抑制经典的Wnt通路，促进非经典的Wnt通路可能是CTHRC1在宫颈癌发生中的重要调控机制。(6) CTHRC1有望成为宫颈癌治疗的新靶点。

目录

摘要

前言

第一部分 1万名妇女宫颈高危型HPV感染分布特点及危险因素分析

前言

材料和方法

结果

讨论

第二部分 宫颈癌细胞系中受HPV16／18致癌基因E6／E7影响的细胞外分泌蛋白的筛选

前言

材料和方法

结果

讨论

第三部分 CTHRC1在HPV16／18阳性的宫颈组织中的表达及其临床意义

前言

材料和方法

结果

讨论

第四部分 CTHRC1在HPV16和18型的宫颈癌细胞中的功能及作用机制

前言

材料

仪器设备

方法

统计分析

结果

讨论

第五部分 血清CTHRC1浓度对HPV16／18阳性宫颈癌及CIN诊断的临床意义

前言

材料和方法

结果

讨论

参考文献

英文缩略词表

附录

综述一 细胞外分泌蛋白CTHRC1的研究进展

综述二 HPV筛查和流行病学在宫颈癌研究中的进展

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致谢

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