转基因大豆、转基因马铃薯与阪崎肠杆菌的荧光PCR和数字PCR检测

摘要

随着转基因的安全性成为社会关注的热点，各国都相继出台了关于标识转基因产品的法规，而市场准入的关键就在于定性或者定量的转基因检测技术。本研究对转基因DAS-44406-6大豆品系、转基因AV43-6-G7马铃薯品系分别进行5′-RACE，测出两个品系外源基因片段和内源基因重组的边界序列，并按照边界特异性序列设计出相应的引物探针对，首次建立了转基因DAS-44406-6大豆品系和转基因AV43-6-G7马铃薯品系的实时荧光PCR和数字PCR检测方法。转基因DAS-44406-6大豆品系和转基因AV43-6-G7马铃薯品系的荧光PCR检测方法在模板DNA浓度为100 ng/反应时，检测低限均为0.01%的转基因含量；建立的转基因DAS-44406-6大豆品系和转基因AV43-6-G7马铃薯品系数字PCR检测方法绝对灵敏度能准确定量到模板DNA浓度分别为0.01 ng/μL和0.001 ng/μL的转基因样品。数字PCR方法相比于传统PCR检测方法具有简便快速、灵敏准确、可绝对定量等特点，这对于转基因品系的实际检测具有很大的应用价值。
　　阪崎肠杆菌（Enterobacter sakazakii）可导致免疫力低下的新生儿神经系统紊乱如脑膜炎以及患菌血症、坏死性小肠结肠炎等疾病，婴幼儿配方奶粉是至今已知的最主要的感染途径。而检测阪崎肠杆菌的关键就在于实时荧光PCR和数字PCR检测方法。本研究首次建立了微滴式数字PCR检测阪崎肠杆菌的绝对定量检测方法。根据阪崎肠杆菌的特异性基因序列，设计引物和荧光探针，并进行筛选，和其它12种近缘的、食品中常见的其它菌种一起进行实时荧光PCR引物和探针的特异性以及检测低限实验，作为数字PCR的准备与参照。以阪崎肠杆菌基因组DNA制备绝对灵敏度与相对灵敏度的梯度稀释DNA进行PCR的定量检测，并确定和验证检测体系的稳定性、精密度、线性范围及检测低限等指标。本研究建立的检测阪崎肠杆菌的QX200数字PCR检测方法定量检测低限为5×10-5 ng/μL，达到实时荧光PCR方法检测低限，同时在阪崎肠杆菌基因组浓度等于5×10-6 ng/μL时，仍可以检出病原菌，说明QX200数字PCR检测方法灵敏度达到甚至超过实时荧光PCR方法。样品DNA模板浓度为5×10-3 ng/μL时，在阪崎肠杆菌基因组DNA相对含量区间为1.5625%-100%情况下具有较好的定量检出阪崎肠杆菌的能力；在样品模板浓度为5×10-3 ng/μL且阪崎肠杆菌在0.78125%-1.5625%时，也可以实现痕量阪崎肠杆菌样品的检出。首次建立的数字 PCR检测方法具有较高的准确性和重复性、较短的检测时间，对快速检测出样品中的阪崎肠杆菌具有重要意义。

目录

引言

第一章转基因DAS-44406-6品系大豆边界序列测定与实时荧光PCR检测

1.1 材料与方法

1.2 结果与分析

1.3 本章小结

第二章 转基因AV43-6-G7品系马铃薯边界序列测定与实时荧光PCR检测

2.1 材料与方法

2.2 结果与分析

2.3本章小结

第三章 阪崎肠杆菌实时荧光PCR检测

3.1 材料与方法

3.2 结果与分析

3.3本章小结

第四章 转基因大豆、转基因马铃薯与阪崎肠杆菌的数字PCR检测

4.1 材料与方法

4.2 结果与分析

4.3本章小结

全文讨论与结论

参考文献

综述

攻读学位期间的研究成果

致谢

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