RPA技术与微滴数字PCR在转基因玉米与大豆检测中的应用

摘要

随着转基因技术的不断发展与应用，转基因产品检测技术的研究对全球转基因产品安全管理至关重要。在这些检测技术中，核酸在恒温下的扩增技术得到了较快的发展。与常规PCR相比，核酸等温扩增技术不再需要热循环仪器，可在恒温条件下快速扩增出目的片段，具有快速、简便、灵敏的优点。其中，重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase ploymerase amplification,RPA)，是核酸在等温条件下进行扩增的一种技术。微滴数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)，是一种核酸检测与定量技术，也是最近几年兴起的新技术。本研究的内容和结果如下：
　　1、RPA结合凝胶检测技术特异性检测转基因玉米 Bt11：本研究根据转基因玉米Bt11外源基因草丁膦乙酰转移酶基因(phosphinothricin acetyl transferase gene,PAT)及载体骨架连接区序列，设计引物，首次建立了基于 RPA与凝胶检测技术相结合的方法，特异性地快速检测转基因玉米Bt11，在37℃条件下20min内即可完成检测。本实验所得该方法的绝对检测限约为100拷贝，相对检测限约为0.1％。
　　2、RPA结合荧光检测技术检测转基因玉米 Bt11外源基因 nos终止子：此研究选用转基因玉米 Bt11为材料，研究 RPA荧光技术检测外源基因 nos终止子的灵敏度，测得绝对和相对检测限分别约为50拷贝和0.1%。与之对比实验，本实验采用荧光定量 PCR染料法检测转基因玉米 Bt11外源基因 nos终止子，实验测得绝对检测限达10拷贝甚至以下，相对检测限为0.1%。荧光定量PCR可对转基因玉米含量进行定量测定，但荧光定量PCR相对检测时间较长，需要两小时以上，并且定量时需要做标准曲线，过程复杂，而应用RPA荧光技术检测时间明显缩短，半小时就可以完成检测。两种技术各有优势，可根据实际需要选取。
　　3、ddPCR测定转基因大豆GTS-40-3-2转基因成分含量：在本研究中，使用了ddPCR和荧光定量PCR对10%的转基因大豆GTS-40-3-2标准品进行了转基因成分含量的测定，两种方法测得转基因含量与实际相符，都约为10%。相比ddPCR方法，荧光定量PCR需要更多的模板量和引物，加样的数量也比较多。采用QX200TM Droplet Digital TM PCR系统，将两套引物和探针加入到同一PCR管中，减少了加样数量，也节省了模板量。在数据分析方面，荧光定量PCR方法需要根据荧光数值构建标准曲线，并通过计算获得基因的拷贝数和转基因成分的含量，而ddPCR不依赖标准曲线，能够通过不同荧光的微滴数目直接获得靶基因的拷贝数，并精确计算出转基因成分所占的百分数。本实验所得ddPCR方法的最低检出限约为2个拷贝。

目录

声明

第一章文献综述

引言

1.1转基因作物的全球发展概况

1.2转基因产品的安全管理

1.3转基因产品的检测方法

1.4重组酶聚合酶等温核酸扩增技术

1.5微滴数字PCR

第二章RPA技术快速检测转基因玉米Bt11

2.1实验材料、试剂与仪器

2.2实验方法

2.3实验结果分析与讨论

第三章RPA荧光技术与荧光定量PCR在转基因产品检测上的比较

3.1 RPA荧光技术在检测转基因上的研究

3.2荧光定量PCR检测转基因玉米Bt11中nos终止子

第四章微滴数字PCR在转基因产品检测上的研究

4.1实验材料、试剂与仪器

4.2试验方法

4.3实验结果分析

4.4讨论

第五章全文小结

5.1 RPA技术快速检测转基因玉米Bt11

5.2 RPA荧光技术与荧光定量PCR在转基因产品检测上的比较

5.3微滴数字PCR在转基因产品检测上的研究

参考文献

攻读硕士学位期间的论文及研究成果

致谢