加压处理对酵母菌（WR-5、Saf）和梨头霉（AS365）代谢的影响研究

摘要

本文初步研究了温和压力(0.1～2.5Mpa，特指较低的高压)在发酵工业中应用的技术可行性。以酵母WR-5、Saf和梨头霉AS365为实验菌株，以A260、A280和电导率为实验观察指标，研究了温和压力处理对微生物细胞膜通透性的影响。通过美兰染色法观察了温和压力处理对上述两株酵母存活率的影响。通过DHA-TTC法研究了温和压力处理对梨头霉AS365生理活性的影响(DHA为脱氢酶活力)。本文从多个方面研究了温和压力对难溶底物RSA在水中溶解性的影响。最后，实验深入研究了温和压力处理对梨头霉转化RSA生成HC的影响。 1、温和压力能显著提高酵母WR-5、酵母Saf、梨头霉AS365的细胞膜通透性，压力越大、加压时间越长，细胞膜通透性越大，表现为菌悬液的电导率、A260、A280不断增大。但是压力大小和加压时间长短并不和电导率、A260、A280呈完全的线形关系。说明压力对细胞膜通透性的影响是多方面的、较为复杂的。通过扫描式电子显微镜观察发现温和压力对微生物细胞的形态有一定的影响，加压处理后的微生物细胞表面出现明显皱折和塌陷，失去了正常的光滑圆润形态。 2、温和压力处理对酵母菌的存活率几乎没有影响，温和压力处理后，酵母菌的存活率几乎为100﹪。只有个别处于发芽繁殖期的酵母细胞和芽体死亡。这说明出芽繁殖期的酵母细胞比较容易受压力的影响。 实验结果表明压力对梨头霉菌丝体生理活性的影响是复杂的，0.5MPa的压力有利于刺激梨头霉，引起其应激反应，从而提高其生理活性，表现为其脱氢酶比活力达到最大值。但是当压力继续上升时，梨头霉脱氢酶的相对活力开始不断下降，2.5MPa处理1小时后梨头霉脱氢酶的相对活力降低至65.6﹪。而0.5MPa处1小时后梨头霉脱氢酶的相对活力达到了最高值112.3﹪。加压时间对梨头霉生理活性也有一定的影响。在加压初期，0.5MPa的压力有利于提高梨头霉生理活性，表现为其脱氢酶比活力不断增大，但随着加压时间进一步延长，压力开始对梨头霉生理活性产生负面影响。 3、本文从几方面研究表明：加压处理能显著增加难溶物质RSA在水中的溶解性。从而有利于增加发酵过程中RSA的传质速率，提高梨头霉发酵过程和11β羟基化反应的效率。 4、研究发现对梨头霉转化RSA生成HC的发酵过程进行阶段性加压处理是完全可行的。压力值、加压发酵时间、加压阶段和加压气源都会对该发酵过程产生显著的影响。过高压力值(＞1MPa)、过长加压发酵时间(＞8小时)、非氧气气源(如氮气)都会对转化反应产生显著的负面影响。在发酵后期加压的效果要远好于在发酵前期加压的效果。氧载体的添加对该好氧发酵过程有明显的促进作用，表现在HC的转化率和产量都普遍得到大幅度的提高。最佳的加压发酵处理条件是：先常压转化32小时，再用高纯空气为介质0.5MPa加压发酵8小时(发酵液中添加氧载体)，然后再常压转化8小时，该条件下HC转化率可比常压对照提高21.3﹪。实验还表明梨头霉脱氢酶比活力和HC转化率有一定的正相关性。但是两者不完全成线性关系。 5、通过扫描电子显微镜观察拍摄压力处理和常压条件下发酵液中梨头霉的形态发现，压力对梨头霉菌丝体的形态有明显影响，不同加压气源对梨头霉的菌丝体的形态也有明显影响。 研究发现合适的温和压力处理可以提高微生物细胞膜通透性、增加或保持微生物的生理活性、提高难溶底物的溶解性，所以温和压力完全可以应用于发酵工业中。

目录

文摘

英文文摘

独创性声明及关于论文使用授权的说明

1.前言

1.1课题意义

1.2细胞膜

1.2.1细胞膜的成分与结构与性质

1.2.2细胞膜的通透性

1.3高压技术及高压对微生物及酶的影响

1.3.1高压对酶的影响

1.3.2高压对微生物的影响

1.3.3高压技术的应用

1.4微生物生物量或生理活性的检测

1.4.1常用测定方法

1.4.2酵母菌生理活性检测

1.4.3梨头酶霉生理活性检测——DHA-TTC法

1.5甾体化合物微生物转化

1.5.1甾体化合物简介

1.5.2微生物甾体转化反应类型

1.5.3新技术在微生物转化中的应用

1.6微生物的11β羟基化转化反应

1.6.1氢化可的松的理化性质及作用

1.6.2 11β羟基化反应的菌种

1.6.3转化反应的底物和产物的多样性

1.6.4 11β羟基化转化反应的工业方法

1.6.5影响11β羟基化转化反应的因素

1.6.6 11β羟基化反应机理

1.7课题主要研究内容

2.材料与方法

2.1材料

2.1.1菌种

2.1.2试剂

2.1.3仪器设备

2.1.4培养基制备（g/L）

2.1.5主要试液制备

2.2方法

2.2.1酵母菌的菌体培养与收集

2.2.2梨头霉活化

2.2.3梨头霉孢子悬浮液的制备

2.2.4梨头霉的液体培养及菌体收集

2.2.5微生物菌体-高纯水悬浮液制备

2.2.6加压处理方法

2.2.7 TF标准曲线的制定

2.2.8 DHA-TTC法计算公式

2.2.9甾体RSA的投料方法

2.2.10酵母菌存活率测定-美蓝染色法

2.2.11梨头霉的转化反应

2.2.12菌体干重的测定

2.2.13孢子计数

2.2.14分光光度计测RSA溶解性

2.2.15 HPLC法分析甾体转化产物

2.2.16 TTC法测定梨头霉脱氢酶活力

2.2.17电导率测定

2.2.18处理后菌悬液的A260、A280测定

2.3主要实验设备介绍

2.3.1微生物高压反应装置

2.3.2显微镜

3.结果与讨论

3.1温和压力下微生物细胞膜的通透性的研究

3.1.1温和压力对酵母Saf细胞膜通透性的影响

3.1.2温和压力对酵母WR-5细胞膜通透性的影响

3.1.3温和压力对梨头霉AS365细胞膜通透性的影响

3.1.4 小结

3.2温和压力下微生物生理活性的研究

3.2.1温和压力处理后酵母菌存活率的研究

3.2.2温和压力处理对梨头霉活性的影响

3.2.3小结

3.3温和压力下RSA在水中的溶解性的研究

3.3.1不同压力相同处理时间对RSA溶解性的变化

3.3.2相同压力不同处理时间对RSA溶解性的变化

3.3.3温度对RSA溶解性的影响

3.3.4小节

3.4温和压力加压发酵对梨头霉转化RSA生产HC的影响

3.4.1合适加压发酵时间的确定

3.4.2以氮气为介质0.5MPa连续48小时分阶段加压发酵

3.4.3以高纯空气为介质0.5MPa连续48小时分阶段加压发酵

3.4.4以高纯空气为介质0.5MPa连续48小时分阶段加压发酵(添加氧载体)

3.4.5梨头霉脱氢酶活力(DHA)对氢化可的松转化率的影响

3.4.6压力对菌体形态的影响

3.4.7小结

4.结论与展望

4.1结论

4.2问题与展望

参考文献

致谢

研究生期间发表的论文