牛传染性鼻气管炎病毒部分gB蛋白的原核表达及应用

摘要

牛传染性鼻气管炎(IBR)又名“红鼻病”，是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)引起的接触性传染病。该病广泛分布于世界各地，且具有广泛的组织嗜性，临床上主要以呼吸道症状和繁殖障碍为特征。近年来，该病的病发率呈现逐年上升的趋势，给养牛业带来了不可估量的经济损失。gB蛋白为IBRV中最保守且是免疫反应最主要的蛋白之一，是进行IBRV诊断首选的特异性抗原之一。基于以上的研究，本试验做了以下三方面的工作:
　　1.IBRV部分gB蛋白的原核表达及纯化
　　为了获得大量的gB蛋白用于后续IBRV检测方法的建立，本试验对实验室保存的构建好的gB重组阳性质粒利用IPTG进行诱导表达，并对诱导条件（诱导时间及IPTG浓度）实施了优化，利用SDS-PAGE分析了表达蛋白的可溶性，最后使用His标签亲和镍柱层析对表达的蛋白进行了纯化和免疫印迹检测。结果表明，重组蛋白得以表达，大小为32.4KDa，与预期一致，且在IPTG浓度为0.5mM诱导4h时gB蛋白获得高效表达，存在形式主要为包涵体。纯化的gB蛋白经测定其浓度为1.84mg/mL，Western blot结果验证，表达的蛋白能够特异性识别IBR标准阳性血清。本研究成功获得了高效表达的gB蛋白，且证实了表达纯化的gB蛋白可以作为检测IBRV的特异性抗原。
　　2.mRV gB蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法的建立
　　为了建立IBRV gB间接ELISA检测方法，本研究将已构建好的gB阳性重组菌落在最佳的诱导条件下进行大量表达纯化，以纯化的gB蛋白作为包被抗原包被96孔酶标板，分别对包被浓度、包被时间、作用的时间等条件进行优化，确定了判断标准，建立了关于IBR抗体检测的间接ELISA诊断方法。特异性试验和重复性试验表明，该方法不与其他常见病原发生交叉反应且具有良好的重复性。用该方法检测了200份来自宁夏各地的血清样品，与IDEXX公司试剂盒检测结果相比较，符合率为90.5％，证明本研究建立的ELISA方法较敏感，特异性好，可以作为IBRV抗体检测的一种方法应用于临床实践。
　　3.基于IBRV gB蛋白的免疫胶体金检测方法的建立
　　为了建立一种适用于兽医临床现场检测IBRV的方法，本试验以兔抗牛IgG为金标抗体，以表达的IBRV gB蛋白为检测蛋白，包被T线，以羊抗兔IgG为质控蛋白，包被C线，确定了最佳包被条件，建立了IBR免疫胶体金抗体检测方法，结果显示该方法具有良好的特异性和敏感性，为IBR的临床诊断奠定了基础。

目录

声明

论文说明

摘要

英文缩略词表

第一章文献综述

1．1国内外IBR流行情况

1．2 IBR概述

1．3 IBRVgB蛋白的研究概述

1．4 IBR的检测方法

1．5国内外IBR防控策略的概述

1．6研究的目的及意义

第二章 IBRV部分gB蛋白的原核表达及纯化

2．1材料

2．2方法

2．3结果

2．4分析与讨论

第三章 IBRVgB蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法的建立

3．1材料

3．2方法

3．3结果

3．4分析与讨论

第四章基于IBRVgB蛋白的免疫胶体金检测方法的建立

4．1材料

4．2方法

4．3结果

4．4讨论与分析

第五章结论

参考文献

附录

致谢

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