六种畜肉基因检测试剂盒研发

摘要

随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，肉制品的需求量逐年攀升，在利益的驱使下，很多商贩为了提高商业利润，在高价肉及肉制品中掺入廉价肉，同时使用各种添加剂调整产品口味及色泽，以达到以假乱真的效果。尤其是牛、羊肉卷和羊肉串等加工制品，消费者难以从纹理和口感上对其进行甄别。这些掺假肉制品的出现不仅严重侵犯了消费者权益，更对消费者的身体健康造成了严重影响。因此，建立一种精准、快速、高通量的检测方法，为动物源性食品监管提供有力的技术支撑，是当前亟需解决的重要问题。
　　本论文基于物种特异性PCR技术，建立了针对牛、羊、猪、狗、马和驴六个畜种源性肉的检测方法，研发了物种特异性PCR检测试剂盒，具体研究结果如下:
　　1.为了筛选出最佳的动物肌肉组织DNA快速提取方法，以牛肉为试材，分别用普通鼓风干燥、真空冷冻干燥、液氮研磨、绞肉机搅碎（空白对照）四种预处理方式搭配SDS法、异硫氰酸胍法、CTAB法、氯仿-醋酸钠法、KI法、苯酚-氯仿法和天根试剂盒法等七种DNA提取方法提取牛肌肉组织DNA，用微量核酸蛋白浓度测定仪测定提取DNA的纯度及浓度、琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性和PCR扩增适应性等方法对所提取DNA进行质量检测。结果表明:对于样品预处理而言，采用液氮研磨可有效防止研磨过程中因发热而导致的DNA降解，7种DNA提取方法中SDS法和天根试剂盒法提取的牛肌肉组织DNA，虽均可满足PCR等后续实验要求，但利用SDS法所提得的DNA在纯度、浓度及稳定性等方面均更优。
　　2.退火温度是影响PCR扩增成功与否的关键因素，为了扩增出清晰目的条带的同时避免杂带对试验结果的判定产生影响，本试验利用梯度PCR技术优化得到了每对引物的最适退火温度，按照牛、羊、猪、狗、马和驴的顺序分别为54℃、65℃、62℃、46℃、67℃和66℃。
　　3.比对重组质粒测序结果与GenBank中的目的基因序列，结果表明:牛、羊、猪和驴的PCR产物序列分别与各自目的序列有着100％、100％、96％和99％的同一性，测序结果进一步证明本实验中牛、羊、猪和驴源重组质粒的制备是成功的，而狗和马源重组质粒经重复测序均显示与盘羊和眼镜猴的目的基因有着高度同源性，原因可能是质粒制备过程中普通Taq DNA聚合酶的使用使得基因发生突变，在今后的实验过程中将考虑高保真Taq酶的使用，以降低突变概率。
　　4.基于前述研究，最终目的在于开发畜种检测试剂盒，该试剂盒包括DNA的提取部分和检测部分，DNA提取部分是将SDS法和天根试剂盒中的吸附柱相结合得到的新型DNA提取方法，该方法集成了SDS法和天根试剂盒的优点，浓度、纯度、DNA完整性和PCR扩增适应性等性能更佳;在前期实验中，已优化了各畜种检测条件，购买者只要按照说明书进行操作就能在2.5h内得到检测结果，方便快捷。在计算该试剂盒的检测成本时，每个样品按重复检测两次计算，约为30RMB/样品，与市面上现流通的一些试剂盒及检测方法相比成本较低，且检测灵敏度较高，有利于后期推广。
　　综上所述，本研究最终研制出的物种特异性PCR检测试剂盒的特异性强、灵敏度高且成本低，可同时对多个样品进行检测。该方法完全可用于熟肉制品的检测，为各食品检验机构提供了方法指导和技术支持，对于食品中畜源性成分的检测具有重要意义。

目录

声明

摘要

1．1研究背景与意义

1．2检测方法研究进展

1．3研究内容和技术路线

第二章最优动物肌肉组织DNA提取方法的筛选与优化

2．1引言

2．2材料与仪器

2．3试验与方法

2．4实验结果

2．5结论与讨论

第三章各畜种特异性引物的筛选及质粒的制备与测序

3．2材料与仪器

3．3试验与方法

3．4实验结果

3．5结论与讨论

第四章物种特异性PCR检测试剂盒的研发

4．1引言

4．2试剂盒的研发

4．3试剂盒成本计算

第五章总结与展望

5．1结论

5．2创新点

5．3后续工作及展望

参考文献

致谢

附录

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