硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选、鉴定及其酶固定化方法的研究

摘要

硫酸软骨素裂解酶(chondroitinase或chondroitinsulfatelyase，ChSase)具有多种药用价值，尤其在制备低分子量硫酸软骨素方面有着广阔的应用前景。本论文对ChSase产生菌的筛选、菌株的鉴定及其产酶特性、酶学性质与酶的固定化方法做了系统的研究。 利用快速平板筛选法从鲤鱼鱼肠标本中筛选出一株产ChSase活性较高的菌株N235，通过形态学观察和生理生化试验，以及对该菌株16srRNA基因序列的分析，将菌株N235归属为温和气单胞菌；对ChSase的表达方式和菌株产酶特性的研究表明，ChSase为胞外酶，菌株N235在30℃发酵36h时产ChSase活性达到最高；采用硫酸铵沉淀法制备了粗酶液，并考察了ChSase的酶学性质。 利用制备的粗酶液为原料，分别使用明胶和海藻酸钠、大孔树脂、磁性PF微球为载体，进行ChSase固定化方法的研究。结果表明：(1)明胶和海藻酸钠协同包埋固定化ChSase的优化条件是：明胶浓度10％，海藻酸钠浓度2％，氯化钙浓度4％，加酶量1U/ml体系，交联剂戊二醛浓度0.05％-0.07％，交联时间10min；利用此条件获得的固定化酶的酶学性质为：最适温度45℃，最适pH7.5，表观米氏常数7.06×10-2g/L，具有一定的操作稳定性。(2)大孔树脂吸附固定化ChSase的优化条件是：吸附温度15℃，吸附时间6h，吸附pH7.0，加酶量150U/g树脂，交联剂戊二醛浓度0.01％，交联时间3h，交联温度4℃；利用此条件获得的固定化酶的酶学性质为：最适温度40℃-50℃，最适pH7.0，表观米氏常数1.46×10-1g/L，具有较好的操作稳定性。(3)磁性PF微球固定化ChSase的优化条件是：对苯二酚8.2g，甲醛15ml，盐酸2ml制备PF凝胶；PF凝胶1.5g制备磁性PF微球；固定温度20℃、固定时间8h、加酶量67.3U/g磁性PF微球制备固定化酶；利用此条件制备的固定化酶的酶学性质为：最适温度50℃，最适pH8.0，表观米氏常数5.23×10-1g/L，具有良好的操作稳定性。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章前言

1.1硫酸软骨素简介

1.2硫酸软骨素裂解酶概述

1.2.1硫酸软骨素裂解酶简介

1.2.2国内外现状

1.3 固定化酶概述

1.3.1固定化酶的定义

1.3.2酶的固定化方法

1.3.3载体改性及新型载体、新型技术的应用

1.3.4展望

1.3.5固定化酶的性质

1.4本论文的立题背景和研究意义

1.5本论文的研究内容

第二章硫酸软骨素裂解酶产生菌的筛选、鉴定与产酶特性研究

2.1实验材料

2.1.1培养基

2.1.2主要试剂

2.1.3主要仪器

2.2实验方法

2.2.1 ChSase产生菌的筛选

2.2.2 ChSase在菌体内表达方式的确定

2.2.3菌株N235的生长曲线与产酶特性的关系

2.2.4菌株N235的菌种鉴定

2.2.5 ChSase活力的测定方法

2.3实验结果

2.3.1 ChSase产生菌的筛选

2.3.2 ChSase在菌体内表达方式的确定

2.3.3菌株N235的生长曲线与产酶特性的关系

2.3.4菌株N235的菌种鉴定

2.3.5菌种归类判定

2.4本章小结

第三章硫酸软骨素裂解酶酶学性质及固定化方法的研究

3.1 ChSase粗酶液的制备及其酶学性质的考察

3.1.1实验材料

3.1.2实验方法

3.1.3实验结果

3.2 ChSase固定化方法的研究

3.2.1明胶海藻酸钠协同包埋法

3.2.2树脂吸附法

3.2.3磁性高分子微球法

3.3本章小结

结 论

参考文献

致 谢

附 录