抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达及其产物分析

摘要

HER2/neu基因是一种原癌基因，位于人染色体17q21，其编码产物p185erbB2蛋白具有酪氨酸激酶活性，为表皮生长因子受体家族成员之一。当HER2/neu基因过度表达时，存在于多种肿瘤组织，包括乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、肺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌等均可检测到该基因。抗HER2人源化单克隆抗体直接作用于p185erbB2胞外域，因而是一种理想的靶向治疗药物。体内外实验均证明：抗HER2人源化单克隆抗体能抑制过度表达HER2/neu基因的乳腺癌细胞生长。 目前，抗体主要采用哺乳动物表达系统生产，但哺乳动物表达系统生产成本高，使每个疗程的抗体药物费用高达数万美元，难以实现抗体药物的广泛应用。乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis，K．．lactis)作为一种较完善的外源基因表达系统，不仅具有易于高密度发酵、外源基因稳定整合在宿主基因组中，可对外源蛋白进行糖基化修饰等酵母共有的优点外，还具有遗传背景清楚和表达系统安全等优点。K．．lactis表达系统已成功表达多种外源蛋白，但尚未见用于全抗体表达的研究报道，因此，本研究拟利用K．．lactis表达系统，以抗HER2单克隆抗体为模型，研究K．．lactis表达系统表达全抗体的能力，并对表达产物进行结构和生物学活性的分析，为开发抗体药物生产新平台奠定基础。 本研究主要结果如下： 1.构建了抗HER2人源化单克隆抗体轻、重链表达载体，实现了全抗体在K．．lactis中的表达。对用于K．．lactis中的信号肽和启动子进行初步分析，结果表明：诱导型启动子LAC4与MFα信号肽的组合能够获得较高的抗体表达水平，摇瓶表达水平可达120±20mg．L-1。 2.表达产物利用HiTraprProteinAFF亲和柱纯化，纯化产物经SDS-PAGE、Westernblot分析以及与PNGaseF酶切分析，结果显示：K．．lactis表达的抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链能够协调表达，并且能够自发通过分子间二硫键正确装配成完整的抗体分子，且抗体的重链发生N-糖基化修饰。 3.ELISA实验结果显示抗HER2人源化单克隆抗体可与其抗原特异性结合。而且该抗体对过度表达HER2基因的SKBR3细胞的生长具有一定的抑制作用。

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论文说明：缩略词表

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引 言

第一章 实验材料

1.1菌株和质粒

1.2工具酶、抗体、转移膜及分子量标准

1.3主要试剂及试剂盒

1.4主要仪器

1.5主要培养基

1.6主要溶液

第二章实验方法

2.1引物设计

2.2基因的克隆

2.2.1 PCR获得β-半乳糖苷酶(LAC4)启动子及其终止子

2.2.2 PCR获得PGK启动子及CYCTT其终止子

2.2.3 PCR获得带有MFα信号肽的抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因

2.2.4 PCR获得HSA信号肽编码序列以及与HSA信号肽融合的抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因

2.3带有LAC4启动子及MFα信号肽的轻、重链基因表达载体的构建

2.3.1带有LAC4启动子及MFα信号肽的轻链基因表达载体的构建

2.3.2带有LAC4启动子及MFα信号肽的重链基因表达载体的构建

2.4带有LAC4启动子及HSA信号肽的轻、重链基因表达载体的构建

2.4.1带有LAC4启动子及HSA信号肽的轻链基因表达载体的构建

2.4.2带有LAC4启动子及HSA信号肽的重链基因表达载体的构建

2.5带有PGK启动子的抗体轻、重链基因表达载体构建

2.5.1带有PGK启动子及MFα信号肽的轻链基因表达载体的构建

2.5.2带有PGK启动子MFα信号肽的重链表达载体的构建

2.6重组表达质粒转化K.lactis(Δura3)宿主菌

2.6.1 K.lactis(Δura3)宿主菌感受态细胞的制备：

2.6.2质粒线性化：

2.6.3重组表达质粒转化K.lactis(Δura3)宿主菌

2.7筛选重组酵母菌株

2.7.1 K.lactis+LAC4-αHL和K.lactis+LAC4-HHL阳性转化子的筛选

2.7.2 K.lactis+PGK-αHL阳性转化子的筛选

2.8对重组酵母菌株进行ELISA筛选和分析

2.9纯化表达上清中的抗体

2.10分析纯化蛋白的糖链

2.11 Western Blot分析纯化蛋白

2.12重链降解蛋白的N-末端氨基酸序列分析

2.13酵母表达抗体的抗原结合特异性的测定

2.14酵母表达抗体的活性测定

第三章 实验结果

3.1相关基因的克隆

3.1.1 LAC4启动子及终止子基因的克隆

3.1.2 PGK启动子和CYCTT终止子基因的克隆

3.1.3带有MFα信号肽的抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因的克隆

3.1.4 HSA信号肽以及与HSA信号肽融合的抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链基因的克隆

3.2抗HER2人源化单克隆抗体的轻、重链表达载体的鉴定

3.2.1 pYES2/och1+LAC4-αL表达载体的鉴定

3.2.2 pPICZαA/ura3+LAC4-αH表达载体的鉴定

3.2.3 pYES2/och1+LAC4-HL表达载体的鉴定

3.2.4 pPICZαA/ura3+LAC4-HH表达载体的鉴定

3.2.5 pYES2/och1+PGK-αL表达载体的鉴定

3.2.6 pPICZαA/ura3+PGK-αH表达载体的鉴定

3.3抗HER2人源化单克隆抗体在乳酸克鲁维酵母中的表达

3.3.1抗HER2人源化单克隆抗体在K.lactis+LAC4-αHL酵母中的表达

3.3.2抗HER2人源化单克隆抗体在K.lactis+LAC4-HHL酵母中的表达

3.3.3抗HER2单克隆抗体在K.lactis+PGK-αHL酵母中的表达

3.4 ELISA分析抗HER2人源化单克隆抗体的表达量

3.4.1比较MFα信号肽和HSA信号肽对抗体表达量的影响

3.4.2比较LAC4启动子和PGK启动子对抗体表达量的影响

3.5表达上清中抗体的纯化并对抗体进一步分析

3.6 Western blot分析纯化蛋白

3.7酵母表达抗体的糖基分析

3.8重链降解条带N-测序结果

3.9纯化抗体与抗原结合活性分析

3.10纯化抗体生物活性测定

第四章 讨论

4.1全抗体在乳酸克鲁维酵母表达系统中的研究

4.2启动子对抗体表达水平的影响

4.3信号肽对抗体表达水平的影响

4.4全抗体的结构分析

第五章 结论

参考文献

致谢

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