亚急性瘤胃酸中毒对奶山羊瘤胃上皮屏障功能影响机制的研究

摘要

本研究采用光镜和电镜技术观察瘤胃上皮组织形态及超微结构的改变，采用Ussing chamber检测瘤胃上皮生理特征参数及HRP的流速，通过RT-PCR和Westernblot从转录和翻译水平分析瘤胃上皮紧密连接蛋白的表达，以期从形态学、上皮通透性和基因表达方面揭示SARA对瘤胃上皮屏障功能的影响及其机制。本研究包括四个部分:
　　1、奶山羊SARA模型的建立
　　选用6只安装有永久性瘤胃瘘管的泌乳期萨能奶山羊，采用自身对照试验设计，通过饲喂非纤维性碳水化合物与中性洗涤纤维(NFC/NDF)比分别为1.40、1.79、2.31、3.23的4种日粮进行诱导，每期15天，后3天采用动态pH值连续监测记录系统对瘤胃pH值进行24h连续监测。结果表明:当日粮NFC/NDF=3.23，NFC摄入量为577.5g，NDF摄入量为178.7g时，瘤胃pH值介于5.2～5.5之间持续时间长达3.83h/d，表明成功建立奶山羊SARA模型。
　　2、SARA对瘤胃上皮形态结构的影响
　　选用9只泌乳期萨能奶山羊，按体重相近原则随机分为三组，即对照组(n=3)，SARA组(n=3)和恢复组(n=3)。对照组:饲喂基础日粮(NFC/NDF为1.40)，SARA组和恢复组:通过依次饲喂NFC/NDF比为1.40、1.79、2.31、3.23的日粮诱导SARA发生，具体见试验一;恢复组:SARA诱导成功后试验动物自由采食青干草4周，进入恢复期。每期试验结束屠宰试验动物，采集瘤胃腹囊组织，采用石蜡切片和透射电镜技术对瘤胃上皮形态结构进行观察。组织切片结果显示:SARA组瘤胃上皮细胞松散，不规则，瘤胃上皮角质层厚度显著增加(P＜0.05)，颗粒层及上皮总厚度显著降低(P＜0.05)，棘状层厚度与对照组和恢复组无显著性差异(P＞0.05)。电镜结果显示:与对照组相比，SARA组瘤胃上皮细胞界限模糊，棘状层出现空泡，紧密连接结构被破坏，细胞间隙增大。恢复组奶山羊瘤胃上皮有部分区域恢复的较好，表现在紧密连接的数量均多于对照组和SARA组，损伤较严重的地方并未很好的恢复，紧密连接结构松散，细胞与细胞之间有空洞出现。
　　3、SARA对瘤胃上皮通透性的影响
　　试验动物和试验设计同试验二。利用尤斯灌流系统对瘤胃上皮的电生理特征及辣根过氧化物酶流速进行测定，研究SARA对奶山羊瘤胃上皮通透性的影响。结果表明:与对照组相比，SARA组和恢复组显著提高了瘤胃上皮Isc、Gt和HRP流速（P＜0.05），而显著降低了瘤胃上皮PD（P＜0.05），SARA组与恢复组组间差异不显著（P＞0.05），提示SARA引起了瘤胃上皮通透性增加，而且恢复组瘤胃上皮仍然维持这种较高的通透性。
　　4、SARA对瘤胃上皮紧密连接蛋白表达的影响
　　试验动物和试验设计同试验二。采用实时定量PCR和Western blot技术检测瘤胃上皮紧密连接蛋白ZO-1、Occludin和Claudin-1 mRNA表达量和蛋白表达量。Real-timePCR结果显示:紧密连接基因ZO-1、Occludin和Claudin-1 mRNA表达量SARA组和恢复组均显著低于对照组(P＜0.05)，SARA组的ZO-1和Occludin mRNA表达水平低于恢复组(P＞0.05)，Claudin-1 mRNA表达水平显著低于恢复组(P＜0.05)。Westernblot结果显示:奶山羊瘤胃上皮紧密连接蛋白Occludin、ZO-1和Claudin-1蛋白表达量SARA组最低(P＜0.05)，对照组最高，恢复组稍高于SARA组(P＞0.05)但显著低于对照组（P＜0.05）。这些结果提示SARA使瘤胃上皮紧密连接基因ZO-1、Occludin和Claudin-1 mRNA表达量和蛋白表达量下调。
　　综合上述:SARA改变了瘤胃上皮形态结构，使屏障功能受损，通透性增加，其机制可能与瘤胃上皮紧密连接蛋白Occludin、ZO-1、Claudin-1 mRNA表达量和蛋白表达量下调有关。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章 文章综述

1 反刍动物亚急性瘤胃酸中毒的研究进展

1．1 亚急性瘤胃酸中毒的定义和界定

1．2 亚急性瘤胃酸中毒的发病率

1．3 亚急性瘤胃酸中毒的监测

2 反刍动物瘤胃上皮的研究进展

2．1 瘤胃上皮的结构特点

2．2 影响瘤胃上皮发育的因素

2．3 瘤胃上皮的屏障功能

2．4 瘤胃上皮的细胞连接

3 Ussing chamber在胄肠道屏障功链中的研究

3．1 Ussing chamber系统的基本构造

3．2 Ussing chamber在胃肠道屏障功能中的应用

4 国内外研究现状

5 研究意义和目的

6 论文总体研究思路

第二章 试验研究

试验一 奶山羊SARA模型的建立

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

试验二 SARA对瘤胃上皮形态结构的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

试验三 SARA对瘤胃上皮通透性的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

试验四 SARA对瘤胃上皮紧密连接蛋白表达量的影响

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

第三章 全文总体讨论与结论

1 总体讨论

1．1 SARA对瘤胃组织形态结构的影响

1．2 SARA对瘤胃上皮通透性的影响

1．3 SARA对癌胃上皮紧密连接蛋白表达量的影响

2 总体结论

3 论文创新之处

4 未来研究展望

致谢

参考文献

作者简介