亚急性瘤胃酸中毒对奶山羊瘤胃上皮通透性及细胞连接蛋白表达的影响

摘要

本研究以奶山羊为动物模型，以瘤胃上皮为主要研究对象，采用递增日粮NFC/NDF比方式诱导建立奶山羊SARA模型，通过对瘤胃上皮组织形态与超微结构、屏障通透性及细胞连接蛋白表达等方面进行研究，探寻 SARA对瘤胃上皮屏障功能的长期损害及可能机制。本论文包括以下四个内容：
　　1.奶山羊SARA模型的构建
　　选用8只泌乳期安装永久性瘤胃瘘管的萨能奶山羊，试验设计为自身对照，分别饲喂非纤维性碳水化合物与中性洗涤纤维（NFC/NDF）比分别为1.40、1.79、2.31和3.23的四种日粮，每种日粮饲喂15d，后3d采用pH连续动态监测系统对瘤胃液pH值进行24h连续监测。结果显示：当日粮NFC/NDF达3.23时，瘤胃液5.2＜pH＜5.5每天持续时间为3.98 h，这表明奶山羊SARA模型建立成功。在诱导SARA发生的过程中，随着日粮NFC/NDF比增加乙酸含量和乙酸/丙酸（A/P）比显著降低（P＜0.05），丙酸含量、丁酸含量和TVFA含量显著升高（P＜0.05），异戊酸和戊酸含量呈升高趋势（P＞0.05），瘤乳酸含量稍有增加（P＞0.05），但均低于1mM。
　　2. SARA对瘤胃上皮形态结构的影响
　　选用12只泌乳期安装永久性瘤胃瘘管的萨能奶山羊，按照体重相近的原则随机分为三组，即对照组（n=4），SARA组（n=4），恢复组（n=4）。对照组饲喂NFC/NDF=1.40的基础日粮，SARA组和恢复组分别依次饲喂NFC/NDF为1.40、1.79、2.31和3.23的日粮诱导奶山羊SARA发生，祥见试验一。在试验动物SARA诱导成功后恢复组奶山羊自由采食青干草30d。每期试验结束后屠宰试验动物，采用石蜡切片和透射电镜技术观察瘤胃腹囊上皮组织的形态结构。结果显示：SARA使瘤胃乳头长度、宽度和表面积显著增加（P＜0.05），乳头密度无显著影响（P＞0.05）；并使瘤胃上皮角质层厚度显著增加（P＜0.05），使上皮总厚度和棘基层厚度显著降低（P＜0.05），颗粒层厚度无显著影响（P＞0.05）。同时SARA使瘤胃上皮紧密连接数量明显减少，结构模糊，细胞间隙增大，棘突层线粒体出现降解；恢复组瘤胃上皮紧密连接数量和完整性均有所恢复。以上结果说明SARA导致瘤胃上皮形态结构和完整性受损。
　　3. SARA对瘤胃上皮通透性的影响
　　试验动物、试验设计与试验二相同。试验动物屠宰后立即采集新鲜的瘤胃腹囊上皮置于Ussing chamber系统中测定瘤胃上皮电生理参数和辣根过氧化物酶与异硫氰酸荧光素的流速，通过以上指标反映 SARA对瘤胃上皮通透性的影响。结果显示：SARA组瘤胃上皮Isc和Gt显著提高（P＜0.05），PD显著降低(P＜0.05)，HRP和FITC的流速显著增加(P＜0.05)；恢复组瘤胃上皮Isc和Gt仍高于对照组（P＞0.05），PD显著低于对照组(P＜0.05)，HRP和FITC流速也显著高于对照组(P＜0.05)。以上结果说明SARA导致瘤胃上皮通透性长期增加。
　　4. SARA对瘤胃上皮细胞连接蛋白表达的影响
　　试验动物、试验设计与试验二相同。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测瘤胃上皮紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-4、Claudin-7、Occludin和ZO-1，间隙连接蛋白Connxin43和桥粒芯蛋白desmoglein1的mRNA表达量和蛋白表达量。结果显示：瘤胃上皮紧密连接蛋白Claudin-4基因的mRNA表达量和蛋白表达量SARA组和恢复组显著高于对照组（P＜0.05），SARA组高于恢复组，但差异不显著（P＞0.05）；紧密连接蛋白Claudin-1、Claudin-7、Occludin、ZO-1、间隙连接蛋白Connxin43和桥粒芯蛋白desmoglein1基因的mRNA表达量和蛋白表达量为SARA组显著低于对照组（P＜0.05），且低于或显著低于恢复组，恢复组显著低于对照组（P＜0.05）。以上结果说明 SARA显著上调了 Claudin-4基因的表达量，显著下调了 Claudin-1、Claudin-7、Occludin、ZO-1、Connxin43和desmoglein1基因的表达量。
　　上述结果表明：奶山羊患 SARA导致其瘤胃上皮屏障功能严重损伤，上皮通透性增加，其机制与瘤胃上皮形态结构与完整性受损、细胞连接蛋白的 mRNA表达量和蛋白表达量改变密切相关。

目录

声明

缩 略 词 表

1 引言

1.1 反刍动物亚急性瘤胃酸中毒的研究进展

1.1.1 亚急性瘤胃酸中毒的定义

1.1.2 亚急性瘤胃酸中毒的判定依据

1.1.3 亚急性瘤胃酸中毒的产生原因

1.1.4 SARA的危害

1.2 瘤胃上皮细胞连接的研究进展

1.2.1 瘤胃上皮结构特点

1.2.2 细胞连接的分类、结构、功能及影响因素

1.3 胃肠道通透性的研究进展

1.3.1 胃肠道通透性的概念

1.3.2 胃肠道通透性的检测

1.4 SARA对瘤胃上皮屏障功能的影响

1.5 研究目的与意义

1.6 研究思路

2 试验研究

2.1 奶山羊SARA模型的建立

2.1.1 材料和方法

2.1.2 结果

2.1.3 讨论

2.1.4 小结

2.2 SARA对奶山羊瘤胃上皮形态结构的影响

2.2.1 材料和方法

2.2.2 结果

2.2.3 讨论

2.2.4 小结

2.3 SARA对奶山羊瘤胃上皮通透性的影响

2.3.1 材料和方法

2.3.2 结果

2.3.3 讨论

2.3.4 小结

2.4 SARA对奶山羊瘤胃上皮细胞间连接蛋白表达的影响

2.4.1 材料与方法

2.4.2 结果

2.4.3 讨论

2.4.4 小结

3 总体讨论与结论

3.1 总体讨论

3.1.1 SARA对瘤胃上皮形态结构的影响

3.1.2 SARA对瘤胃上皮通透性的影响

3.1.3 SARA对瘤胃上皮细胞连接蛋白基因mRNA表达量和蛋白表达量的影响

3.2 总体结论

4 论文创新之处

5 未来展望

致谢

参考文献

作 者 简 介