曲古抑菌素A诱导牛胎儿成纤维细胞凋亡的研究

摘要

自1997年首例体细胞核移植克隆绵羊多利诞生以来，哺乳动物体细胞核移植技术得到了快速发展，但目前克隆效率低下和胚胎发育异常等仍是体细胞克隆技术所遇到的突出问题。近年来研究表明，卵母细胞胞质对供体细胞的表观遗传重编程不完全与发育异常的问题引起了人们的关注。人们尝试使用影响DNA甲基化及组蛋白修饰等药物处理供体细胞来提高克隆效率及克隆胚胎发育，但有关这些药物对胚胎发育的作用还存在争议。
　　为探讨组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(TSA)处理对供体细胞的影响及其诱导供体细胞凋亡的作用机制，本研究使用不同浓度（0μM、0.05μM、0.10μM、0.20μM、0.40μM、0.80μM、1.60μM、3.20μM）TSA处理牛胎儿成纤维细胞，于处理24 h、48 h和72 h后，用倒置相差显微镜观察细胞形态的变化，MTT比色法检测细胞增殖活性的变化，流式细胞术经PI单染法检测细胞周期的变化，流式细胞术经AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡的变化，Realtime PCR检测Bcl-2，Bax， Cytc，Caspase-9，Caspase-3等凋亡相关基因表达的变化，重亚硫氢酸盐测序法检测凋亡相关基因启动子区DNA甲基化水平的变化。主要研究结果如下:
　　1.TSA对细胞形态、增殖、细胞周期、及凋亡的影响
　　低于0.40μM的TSA处理牛胎儿成纤维细胞不影响其形态，0.40μM以上的TSA处理牛胎儿成纤维细胞时，随TSA浓度增大、处理时间延长，脱壁的死细胞数目逐渐增加。
　　TSA处理24 h、48 h和72 h后，均能抑制牛胎儿成纤维细胞的增殖活性，并具有剂量、时间依赖性。处理24 h时，细胞相对增殖率从98.64％逐渐降低到60.18％，48h时，从98.69％逐渐降低39.20％，72 h时，从96.20％逐渐降低22.47％。
　　TSA处理牛胎儿成纤维细胞24 h、48h和72 h后，均使G0/G1期细胞比例显著增高，S期和G2/M期细胞比例显著降低。当TSA浓度低于0.80μM时，G0/G1期细胞比例随TSA浓度增加而逐渐增高，S期和G2/M期细胞比例随TSA浓度增加而逐渐降低;当TSA浓度高于0.80μM时，G0/G1期细胞比例又略有降低，S期和G2/M期细胞比例又有所升高。
　　TSA处理牛胎儿成纤维细胞诱导其发生凋亡。处理24 h后，早期凋亡率从4.55％逐渐升高到21.20％，晚期凋亡率从1.31％升高到6.08％，死细胞率从0.44％升高到2.93％，活细胞从93.7％逐渐降低到69.09％;处理48h和72 h后，早期和晚期凋亡率进一步升高，活细胞率进一步降低，并呈现剂量依赖性。
　　2.凋亡相关基因表达及相关基因启动子区DNA甲基化水平的变化
　　0.80μM TSA处理牛胎儿成纤维细胞24 h、48 h和72 h后，随着TSA处理时间的延长下调了凋亡抑制基因Bcl-2的表达，相应的其调节区DNA甲基化水平在48h有所增加，24 h和72 h没有明显的变化。随着TSA处理时间的延长上调了促凋亡基因Bax的表达，相应的调节区DNA甲基化水平在48h有所增加，24 h和72 h没有明显的变化。随着时间的延长上调了促凋亡基因Cytc、Caspase-9和Caspase-3的表达。本研究说明TSA能够通过改变供体细胞的表观遗传修饰调节细胞凋亡。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 TSA处理成纤维细胞后对细胞的形态、增殖、细胞周期及凋亡的影响

引言

实验使用材料与方法

1．实验使用材料与仪器

2 试验的方法

实验结果

1 牛胎儿成纤维细胞的生长曲线

2 TSA对牛胎儿成纤维胞增殖活性的影响

3 不同浓度TSA处理对细胞形态的影响

4 不同浓度TSA处理对细胞周期及细胞凋亡的影响

讨论

附图

第二章 TSA处理牛成纤维细胞对调亡基因的表达影响

引言

实验使用材料与方法

1 实验的材料

2 实验方法

实验结果

1 凋亡相关基因表达检测TSA对牛成纤维细胞的影响

2 TSA对凋亡相关基因启动子区DNA甲基化水平的影响

讨论

参考文献

文献综述 体细胞核移植中表观遗传修饰研究进展

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文