曲古抑菌素A与5-杂氮-2'-脱氧胞苷影响牛胎儿成纤维细胞表观遗传修饰及相关基因表达的研究

摘要

随着体细胞核移植技术的创立和成熟，以不同类型细胞作为供体细胞在多个物种中都获得了成功，但体细胞核移植效率仍较低。研究表明，体细胞表观遗传重编程程度影响克隆胚胎发育率，体细胞重编程不充分是导致早期胚胎死亡和出生异常的主要原因。DNA甲基化和组蛋白乙酰化是重要的表观遗传修饰，与染色质的结构、基因的表达有着密切的联系。有研究证明组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A(TrichostatinA)和DNA甲基化转移酶抑制剂5-杂氮-2-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine)处理供体细胞，能够提高克隆效率。但是这些药物对供体细胞表观遗传修饰所产生的影响及提高核移植效率的机理还不是很清楚。本研究分别使用不同浓度的TSA和5-Aza-dC药物处理牛胎儿成纤维细胞，观察对细胞生长状态、组蛋白乙酰化水平的影响，检测表观修饰相关基因和多能基因表达及多能基因启动子区DNA甲基化的变化。为探讨DNA甲基化和组蛋白修饰药物对提高细胞重编程的作用机理。
　　1.TSA对牛胎儿成纤维细胞生长、形态、组蛋白乙酰化水平的影响
　　(1)分别用0、10、25、50、75ng/mlTSA处理牛胎儿成纤维细胞24h，细胞计数法观察细胞生长情况。结果显示，细胞生长曲线总体趋势为S型，在相对较低浓度10、25ng/ml处理下，细胞增殖被抑制，当TSA的浓度达50、75ng/ml时，细胞大量死亡。(2)分别使用0、10、25、50、75ng/mlTSA处理牛胎儿成纤维细胞12h，免疫荧光检测组蛋白修饰的变化。结果显示，随着TSA浓度的增加，组蛋白H3K9、H3K14乙酰化、H3K9三甲基化水平明显升高。
　　2.TSA处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因表达及其启动子区DNA甲基化的影响
　　(1)使用TSA处理牛胎儿成纤维细胞，荧光定量PCR法检测多能基因表达的变化。结果显示，在0、10、25、50、75ng/mlVPA处理24h情况下，TSA上调OCT4、NANOG表达量，且有剂量依赖效应;在25ng/mlTSA处理6h、12h、24h、36h、48h、60h情况下，OCT4在24h时表达量最高，NANOG在12h时表达量最高。(2)使用重亚硫酸盐测序法检测了TSA处理对OCT4、NANOG、SOX2基因启动子区DNA甲基化状态变化的影响。结果表明，TSA处理后OCT4基因启动子区DNA甲基化水平下降较明显，NANOG、SOX2启动子区DNA甲基化状态没有明显变化。
　　3.5-aza-dC单独及与TSA联合处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因及表观修饰相关基因表达的影响
　　(1)分别用0、0.125、0.25、0.5、1μMDNA甲基化转移酶抑制剂5-aza-dC处理牛胎儿成纤维细胞72h，细胞计数法观察细胞生长情况。结果显示，细胞生长曲线总体呈S型,与对照组相比，处理组细胞的生长受到一定程度抑制。(2)使用荧光定量PCR检测不同浓度5-aza-dC处理对多能基因和表观修饰相关基因表达的影响。结果显示，5-aza-dC处理对多能基因OCT4、NANOG表达量无显著影响，对组蛋白去乙酰化酶1(HDAC1)基因的表达量也无显著影响，但显著降低了DNA甲基化转移酶1(DNMT1)基因的表达量。(3)5-aza-dC与TSA联合处理牛胎儿成纤维细胞，荧光定量PCR检测多能基因表达水平变化。结果显示，联合处理提高了OCT4表达水平，对NANOG表达量无显著影响。
　　结论:TSA处理能够提高牛胎儿成纤维细胞整体组蛋白H3K9、H3K14乙酰化和H3K9三甲基化水平，上调多能基因OCT4和NANOG的表达;5-Aza-dC处理能降低DNA甲基化转移酶1(DNMT1)的表达。这些变化可能有利于使成纤维细胞处于更适合的核移植供体状态。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 TSA处理成纤维细胞对其生长、形态及组蛋白乙酰化水平的影响

引言

1 实验材料

1．1 试剂

1．2 仪器

2 实验方法

2．1 牛胎儿成纤维细胞的原代培养

2．2 牛胎儿成纤维细胞的传代培养及冷冻复苏

2．3 牛胎儿成纤维细胞生长曲线的测定

2．4 细胞免疫荧光染色

3 实验结果

3．1 TSA对牛胎儿成纤维细胞生长的影响

3．2 TSA对牛胎儿成纤维细胞形态的影响

3．3 TSA对牛胎儿成纤维细胞组蛋白乙酰化水平的影响

4 讨论

参考文献

第二章 TSA处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因表达及在其启动子区甲基化的影响

引言

1 实验材料

1．1 试剂

1．2 细菌和质粒

1．3 分子生物学试剂

1．4 仪器

2 实验方法

2．1 收集细胞及细胞总RNA提取

2．2 反转录合成cDNA

2．3 荧光定量PCR检测牛胎儿成纤维细胞多能基因及甲基化相关基因的表达量水平变化

2．4 RT-PCR检测牛胎儿成纤维细胞TET1、TET2、TET3基因的表达量水平变化

2．5 TSA处理牛胎儿成纤维细胞后基因组DNA的提取

2．6 TSA处理牛胎儿成纤维细胞后基因组DNA的甲基化处理

2．7 重亚硫酸盐PCR测序法检测多能基因启动子区CpG位点甲基化状态

2．8 启动子目的条带的胶回收、连接及转化

2．9 BSP-DNA阳性细菌克隆测序

3 实验结果

3．1 TSA处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因表达的影响

3．2 TSA处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因启动子区甲基化水平的影响

3．3 荧光定量PCR及RT-PCR检测牛胎儿成纤维细胞甲基化相关基因的表达量变化

4 讨论

参考文献

第三章 5-Aza-dC单独及与TSA联合处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因及表观修饰相关基因表达的影响

引言

1 实验材料

1．1 试剂

1．2 分子生物学试剂

1．3 仪器

2 实验方法

2．1 5-Aza-dC处理牛胎儿成纤维细胞的生长曲线的测定

2．2 收集细胞及细胞总RNA提取

2．3 反转录合成cDNA

2．4 荧光定量PCR检测牛胎儿成纤维细胞多能基因的表达量水平变化

3 实验结果

3．1 5-Aza-dC对牛胎儿成纤维细胞的生长的影响

3．2 5-Aza-dC处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因表达的影响

3．3 5-Aza-dC与TSA联合处理牛胎儿成纤维细胞对多能基因表达的影响

3．4 5-Aza-dC处理牛胎儿成纤维细胞对表观修饰相关基因表达的影响

4 讨论

参考文献

第四章 文献综述

1 表观遗传修饰研究进展

1．1 DNA甲基化与去甲基化

1．2 组蛋白乙酰化与去乙酰化

2 体细胞核移植与克隆胚胎异常现象及影响因素

2．1 克隆胚胎异常现象

2．2 影响体细胞克隆效率的因素

3 细胞重编程领域的研究进展

3．1 细胞重编程主要发展历程

3．2 细胞重编程影响因素与重编程相关的基因及分子机制

4 表观遗传修饰与体细胞核移植重编程的关系

4．1 DNA甲基化与体细胞核移植重编程的关系

4．2 组蛋白乙酰化与体细胞核移植重编程的关系

5 对供体细胞核重构胚表观遗传修饰的改进

5．1 HDACs抑制剂对供核细胞表观修饰的改进

5．2 DNA甲基化酶抑制剂5-Aza-dC对供核细胞表观修饰改进

参考文献

致谢

攻读学位期间发表的论文