利用人K14启动子和Cre/LoxP系统构建绒山羊VEGF164基因真核表达载体并转染细胞

摘要

内蒙古白绒山羊是中国优秀绒山羊品种，具有很高的应用价值。通过转基因克隆技术使外源基因在皮肤细胞内超表达，进而促进毛囊发育和绒毛生长是培育高产量绒毛动物品系的一种有效途径。考虑到转基因动物的安全性问题，选择性删除标记基因是解决这一问题的主要策略。本研究通过利用人K14启动子和Cre/LoxP基因敲除体系，构建皮肤特异性表达绒山羊VEGF164基因的真核表达载体pKV-L，分别稳定转染绒山羊胎儿成纤维细胞和皮肤成纤维细胞，获得稳定表达红色荧光蛋白的转基因的细胞克隆，检测VEGF164基因在不同细胞中的表达量，筛选转基因细胞，以为后续体细胞核移植提供核供体。
　　实验以pDsRed2-1载体为基本骨架采用PCR技术在pDsRed2-1的多克隆位点添加loxP序列及酶切位点。通过双酶切与K14-VEGF-PolyA片段连接，最后添加CMV启动子成功构建皮肤特异性表达VEGF164基因并可选择性删除标记基因的真核表达载体pKV-L。pKV-L载体转染内蒙古白绒山羊胎儿成纤维细胞和皮肤成纤维细胞以lipofectamineTM2000介导，进而采用半定量RT-PCR检测VEGF mRNA在绒山羊胎儿成纤维细胞和皮肤成纤维细中的表达量。
　　测序结果显示，成功构建了皮肤特异性表达VEGF164基因并可选择性删除标记基因的真核表达载体pKV-L，载体元件均按顺序正确连接有K14启动子、VEGF164基因、PolyA、Loxp序列、CMV启动子和红色荧光蛋白基因，载体构建正确。pKV-L稳定转染的细胞经PCR检测，外源基因整合入细胞基因组中，半定量RT-PCR检测表明外源VEGF164基因在细胞中得到表达，皮肤成纤维细胞中的表达量高于胎儿成纤维细胞中的。
　　本研究成功构建稳定表达皮肤特异表达VEGF164基因的真核表达载体，既实现了特异性表达，又实现了可以条件性删除标记基因的目的。使用的人K14启动子在绒山羊细胞中具有皮肤特异性表达的特性。获得的转基因细胞系，为获得皮肤特异性超表达VEGF164基因绒山羊新品系提供了条件。引入的Cre/LoxP基因敲除系统为在子代转基因产品中删除标记基因除奠定了基础，为保障转基因产品的安全性提供了条件。

目录

声明

摘要

缩略词表

引言

参考文献

第一章 中间载体pMD19T-loxP-DsRed2-loxP的构建

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第二章 表达载体pKV-L构建并转染绒山羊胎儿成纤维细胞和皮肤成纤维细胞

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第三章 外源基因在转基因细胞系中的表达检测

1 材料与方法

2 结果与分析

3 讨论

第四章 文献综述

1 血管内皮生长因子

2 毛囊

3 红色荧光蛋白(DsRed)

4 Cre／LoxP重组系统的特点

参考文献

结论

攻读硕士学位期间所发表的学术论文

致谢