乙型肝炎病毒基因分型芯片特异核酸片段的制备

摘要

乙型肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus HBV)导致的肝脏疾病。目前国际上已公认HBV分为A—H8个基因型。大量资料表明，慢性乙型肝炎的地理分布，临床表现，治疗方法，疗效和预后均与感染的HBV基因型有密切关系。因此HBV的基因分型成为乙型肝炎基因诊断研究的一个重要方面。利用基因芯片技术检测HBV基因型，具有灵敏度高，所需样本微量和操作简便等优点。但是，目前HBV基因分型芯片也存在许多不足：1.现有的HBV基因分型芯片仅能进行单一基因型的检测，未能在一张芯片上同时检测8种基因型样本。2.模板是构建基因芯片的关键，样本一般取自病人血清，但由于不同基因型HBV地理分布不同，任何地区要获取全部A—H8种基因型HBV样本比较困难而且昂贵。3.传统芯片方法步骤复杂且芯片杂交后，样品DNA与探针结合稳定性不好，清洗时容易脱落，影响杂交信号强度。这些不足大大阻碍了HBV基因分型芯片技术的发展。 本研究首先通过对各型HBV基因组序列的分析、比对，发现利用在HBVDNA重要开放读码框架的S基因区简并序列中的第228，244，288，324，360，403的6个碱基位点的不同组合，就有可能鉴别8个基因型。这些特异序列较短，制备方便。从而可以实现在一个芯片上同时鉴别8个基因型。 其次，SOEing法(gene splicing by overlap extension重叠区扩增基因拼接法)作为一种简便的引入点突变的方法，可利用此法，用本地区现有的HBV基因型序列为模板，在上述位点引入相应的点突变。就能制备出各基因型的特异序列用作模板，解决了获取全部HBV基因型样本难的问题。 本实验室采用特别设计的基因芯片盒与空气变温PCR扩增仪将PCR和杂交两步合并为一步，在液相中进行不对称PCR扩增的同时在固液相进行杂交并延伸，达到基因分型的目的，缩短了基因芯片流程。并且由于其探针设计的特点，利用此种方法可以对单个碱基的变异进行检测，并且延伸后的探针与样品DNA的结合更为牢固、稳定，其信号强度更佳。 通过本研究初步证明实验结果与预期结果一致，为构建HBV基因亚型全分型芯片及其临床应用奠定了基础。 实验方法： 一、实验材料 C型HBV病毒样本为本实验室保存； 感受态JM109菌，pMD—18T质粒，rTaq酶，pyrobest酶 限制性内切酶EcoRI、Ncol，VentR—(exo—)DNA聚合酶 质粒提取试剂盒、PCR产物切胶回收试剂盒 PCR扩增仪(BiometraPersonalPCRsystem，Germany) 生物芯片点样仪(MicroGrindⅡ600，BiorobticsLtd，England) 激光共聚焦扫描仪(GeneTACTMLSⅣ，GenomicSolutionsInc．USA) 空气变温PCR扩增仪和原位延伸基因芯片盒(实验室自制) 二、实验方法 1.在NCBI数据库中收集A—H八种基因型HBV的全基因组序列。利用生物信息学软件进行分析比对。筛选出分型位点。 2.根据选择的位点设计探针及引物，并且分析其特异性。 3.通过SOEing法制备包含分型碱基位点的特异核酸片段并测序。 4.利用不具有3’—5’外切酶活性的VentR—(exo—)DNA聚合酶通过常规PCR对制备出的特异核酸片段进行验证。 5.制备基因芯片：处理片基，按预先设计好的微阵列点阵使用生物芯片点样仪将探针点到芯片上，水化，烘烤固定并且与基因芯片盒组装备用。 6.以制备出的特异核酸片段作为模板进行芯片验证。 结果： 1.通过生物信息分析，初步筛选出HBV基因分型的6个特异碱基位点。 2.利用SOEing法成功制备出包含分型碱基位点的8个基因型特异核酸片段。 3.已对制备出的HBVA—H8种基因型特异片段的6个分型碱基位点做了PCR验证，结果与预期结果一致。 4.以制备出的特异核酸片段作为模板进行芯片检测，结果与预期结果一致。 结论： 1.SOEing法是一种简便引入点突变的方法。可以应用此法制备HBV基因分型芯片检测所需的模板DNA序列。 2.通过测序，常规PCR以及新型的核酸探针原位延伸基因芯片对制备的HBV特异核酸片段进行检测，证明了这些序列的准确性。 3.初步证明新型的核酸探针原位延伸基因芯片盒能够进行HBV基因分型。

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综述：HBV基因分型研究进展

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