细胞色素P450 4F2多态V433M对其泛素化的影响

摘要

高血压是最常见的心血管病，也是心肌梗死、脑卒中和终末肾衰等独立危险因素，是全球范围内的重大公共卫生问题。每年因心血管病造成的卫生资源消耗非常巨大，其中高血压排在第一位。因此，通过血压调节机制的深入研究寻找高血压干预新靶标，为预防和控制心血管病提供理论支撑已成为一项迫切的任务。众所周知，高血压是遗传和环境因素共同作用的一类常见复杂疾病，由多个基因的基因型及其特定组合的累积效应及环境因子应答所决定。本课题组前期围绕几个重要的血压调节途径，深入探讨了高血压的致病机制。特别是在花生四烯酸ω-羟化酶代谢途径在血压调节中的作用方面并取得了一系列重大科学发现。
　　 人花生四烯酸ω-羟化酶主要包括细胞色素P450(cytochrome P450，CYP)4F2和CYP4A11，其代谢产生的20-羟廿碳四烯酸(20-HETE)对血压的调节具有双重效应:一方面收缩肾脏微小血管，引起血压升高;另一方面抑制肾脏水钠重吸收，降低血压。我们前期通过关联研究和功能鉴定发现CYP4F2基因调控区单体型之一是高血压发生的独立危险因素，该单体型携带者的尿20-HETE水平较高。随后构建的人CYP4F2转基因小鼠模型进一步证实了CYP4F2基因对血压表型的影响。此外，不同人群关联研究结果提示，位于CYP4F2基因编码区的一个单核苷酸多态性（coding single nucleotide polymorphism，cSNP）——V433M(rs2108622)与高血压等心脑血管病相关。然而，关于V433M对CYP4F2ω-羟化酶活性影响的功能研究鲜有报道。
　　 本研究拟分别构建野生型(433V)和变异型(433M)的CYP4F2 pcDNA3.1表达载体，转染后检测野生型和变异型ω-羟化酶活性、蛋白和mRNA表达水平，以深入鉴定CYP4F2多态V433M的功能。
　　 材料与方法
　　 1、以人肾cDNA文库为模板PCR扩增CYP4F2全长cDNA，将CYP4F2cDNA片段连入pMD18-T克隆载体中，然后亚克隆到pcDNA3.1载体，构建野生型CYP4F2表达载体(p4F2-433V);以野生型CYP4F2表达载体(p4F2-433V)为模板，定点突变方法构建变异型表达载体(p4F2-433M)。
　　 2、常规培养人胚肾细胞系HEK293，应用Lipofectamine2000瞬时转染CYP4F2表达载体，应用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide，CHX)(10μg/mL)和/或蛋白酶体抑制剂MG132（10μM）处理不同时间后提取蛋白。
　　 3、提取细胞微粒体，与花生四烯酸共孵育后，应用液相色谱-质谱(LC-MS/MS)方法检测ω-羟化酶活性。
　　 4、Real-time PCR:提取细胞总RNA，反转录成cDNA，Real-time PCR方法检测CYP4F2 mRNA水平。
　　 5、Western blot:提取细胞总蛋白，聚丙烯酰胺凝胶电泳，ECL化学发光方法检测CYP4F2蛋白质水平。
　　 6、免疫沉淀:细胞总蛋白裂解液中加入2μg CYP4F2或IgG抗体，Protein A/Gagarose beads孵育，离心收集免疫共沉淀复合物，泛素/CYP4F2抗体进行Westernblot检测。
　　 结果
　　 1、通过PCR扩增肾cDNA文库，成功构建了野生型CYP4F2 pcDNA3.1表达载体(p4F2-433V)，并应用定点突变方法构建了变异型CYP4F2表达载体(p4F2-433M)，DNA测序证实插入方向及序列正确。
　　 2、通过转染人胚肾细胞系HEK293，提取细胞微粒体，LC-MS/MS方法检测发现野生型CYP4F2(433V)ω-羟化酶活性明显高于变异型(433M)(P＜0.01)。
　　 3、Western blot结果显示野生型CYP4F2(433V)蛋白水平显著高于变异型(433M)(P＜0.05)，进一步应用Real-time PCR检测发现野生型和变异型mRNA水平无显著差异（P＞0.05）。
　　 4、应用CHX(10μg/ml)处理后CYP4F2蛋白降解明显(P＜0.05)，且变异型CYP4F2蛋白降解迅速。
　　 5、应用MG132对过表达CYP4F2的HEK293细胞进行预处理，结果显示，MG132预处理明显抑制了CYP4F2蛋白降解;免疫沉淀-Western blot检测结果显示，变异型CYP4F2结合的多聚泛素链显著多于野生型，提示CYP4F2经泛素-蛋白酶体途径降解。
　　 结论：
　　 1、泛素-蛋白酶体可能是CYP4F2降解途径之一;
　　 2、V433M多态性可能影响CYP4F2泛素化，变异型蛋白泛素化程度高，降解迅速。

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