细胞色素P450 4F2基因的克隆、突变、表达和纯化

摘要

目的构建人细胞色素P450 4F2基因野生型、V81G和V433M突变型表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化出CYP4F2蛋白。方法用RT-PCR方法从人肾脏总RNA中逆转录扩增CYP4F2,将其插入克隆载体pMD18-T Simple Vector中,将测序鉴正确的CYP4F2基因N、C端改造,克隆构建重组表达载体pCWori+-CYP4F2(His)_4-WT。同时采用重叠PCR定点突变法构建pCWori +-CYP4F2 V81G(His)_4和pCWori+-CYP4F2 V433M(His)_4表达载体,分别转化至E.Coli XL-Blue中表达。结果经IPTG诱导可有效表达CYP4F2和突变体V81G与V433M,经Western blot分析可以观察到分子量为57 kD的诱导表达条带,该表达蛋白可与His-Probe多克隆抗体起特异反应。用His- bind亲和层析纯化得到了纯度较高的His融合蛋白。结论用基因工程技术在大肠杆菌中有效表达人CYP4F2基因野生型、V81G和V433M突变型蛋白、并得到了纯度较高的CYP4F2蛋白,为进一步研究其生物学功能及研制相应抗体奠定了基础。